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2020-03-11追捕新型冠狀病毒的福爾摩斯？談張鋒的SHERLOCK試紙型檢測法
459 期
Author 作者
黃子懿／臺灣大學醫學系一年級生；陳佑宗／臺灣大學基因體暨蛋白體醫學研究所副教授。
近日新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）疫情持續延燒，相關各界研究更是如火如荼地進行。今（2020）年2月14日，美國麻省理工學院（Massachusetts Institute of Technology, MIT）張鋒等人宣布，他們與博德研究所（Broad Instituteof MIT and Harvard）、麥戈文腦科學研究所（McGovern Institute forBrain Research, MIT）等機構，將一種運用CRISPR／Cas13a、名為「SHERLOCK」的試紙型快速檢測法應用在SARS-CoV-2引起的2019冠狀病毒疾病（COVID-19）篩檢上，並能在一小時內得知樣本中是否存在病毒RNA，被視為是未來檢疫的重要研究及發展方向（Zhang F et al., submitted，圖一）。本文將介紹這項取名源自小說偵探人物夏洛克．福爾摩斯（Sherlock Holmes）的新興技術。
回到源頭－細菌的CRISPR／Cas
想瞭解SHERLOCK的操作原理，得先知道該檢測法所使用的技術──CRISPR／Cas系統。
CRISPR的全名為Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（群聚且有規律間隔的短回文重複序列），是在細菌DNA中發現的一系列重複序列，可視為細菌的一種免疫機制。當細菌遭噬菌體（一種病毒）感染時，便會切取一小段噬菌體的DNA，然後儲存於CRISPR之間的間隔序列（spacer），以便未來再次遭到感染時，能更快識別並摧毀同種噬菌體。而Cas指的是由CRISPR相關基因（CRISPR associated gene，簡稱cas基因）所編碼的蛋白質酵素，會受引導RNA（guide RNA, gRNA）領導跟特定核酸序列結合，專一性相當高，功能包含解開DNA雙螺旋、切割DNA和RNA分子等（圖二）。科學家們利用細菌這一套獨特的免疫機制，設計出一系列能修改核酸分子的工具。
圖二：CRISPR的可能機制示意圖。
（屬於第二類、第二型）。而SHERLOCK這個技術的主角則是CRISPR／Cas13（屬於第二類、第六型），與CRISPR／Cas9的差異在於：前者結合並切割RNA，後者則是針對DNA。
福爾摩斯登場－解決基因檢測的靈敏度問題
SHERLOCK是張鋒和團隊在2017年4月發表於Science期刊的CRISPR檢驗方式，全名為Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing（特異性高靈敏度酶促報導受質解鎖）（Gootenberg JS et al., 2017）。其中所用的Cas13a蛋白質（LwaCas13a）來自韋德纖毛菌（Leptotrichia wadei，暫譯），具有特殊的「附帶切割（collateral cleavage）性質」。從下頁圖三中可以看到，當Cas13a經gRNA引導跟目標RNA結合後，會無差別地切割周遭所有的RNA分子，無論它們是否為目標序列（target sequence）。
張鋒等人利用Cas13a的這個特性，結合設計好的、針對特定病原基因體序列的gRNA，並搭配一種經特殊設計、被切割後會發出螢光的報導RNA（reporter RNA），驗證了SHERLOCK能偵測病毒RNA，且靈敏度可達50飛莫耳每升（femtomolar）等級（1fM=10-15M）。儘管這樣的靈敏度已較過去其它Cas13蛋白質來的高，但臨床診斷應用需要達到阿莫耳每升（attomolar）等級（1 aM=10-18M），約等於每微升（μL）樣本中僅含1個核酸序列分子即可被偵測）的等級。於是他們嘗試結合許多不同的等溫放大法（isothermal amplification），最後發現重組酶聚合酶放大（recombinase polymerase amplification, RPA）是最適合的，能夠讓靈敏度達到這個等級。
RPA是利用已經設計好的引子（primer）和目標序列鹼基配對，再搭配重組酶以及聚合酶大量擴增原樣本中的核酸含量。相較於需要反覆升溫、降溫的聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction, PCR），RPA可以在37~42℃間等溫反應，因此不需要熱循環機（thermocycler），使用上更為便捷。不過須注意的是，RPA最終產物為DNA，所以尚需經來自T7噬菌體的T7 RNA聚合酶轉錄成RNA，才能與Cas13a反應（圖四）。
圖四：SHERLOCK 的基本流程。
多種病毒檢測，都難不倒它
找到最佳方法後， 研究團隊便合成茲卡病毒（zika virus, ZIKV）和登革熱病毒（flavivirus dengue, DENV）的RNA，將它們包覆於慢病毒（lentivirus）中測試SHERLOCK。結果顯示，SHERLOCK能偵測到濃度僅2阿莫耳每升的病毒RNA，且能區別過去因症狀相似而常無法分明的茲卡病毒和登革熱病毒。同時，SHERLOCK也能檢測出病人血清、尿液或唾液中的茲卡病毒，為其未來臨床應用奠下良好基礎。
到了2018年4月，張鋒的研究團隊更進一步發表改良後的技術，結合濾紙層析（lateral flow），使未被切割的報導RNA可附著於試紙上的底線，被切割的部分則附著於試紙上方。如此一來，SHERLOCK便成為僅需將試紙浸入經RPA處理、Cas13a反應後的樣本就能知道結果的試劑組，如同驗孕棒一般簡單，過程不須使用昂貴的設備。此外，原本一次只能針對一種目標，改良後最多可以同時偵測四種目標序列，因此能減少樣本取量。該檢驗法除了可偵測傳染性病毒，也擴展至檢驗致癌的基因變異、識別某些具抗生素耐藥性細菌的基因等。
一小時追捕兇手－SHERLOCK三步驟檢測COVID-19
不過讀者應該更想知道，該試劑如何用在此疾病的篩檢上吧！
目前檢驗冠狀病毒，主要利用反轉錄聚合酶連鎖反應（簡稱RTPCR），過程至少需要四小時，且僅大型醫院具備相關儀器，使得醫療體系面對大量要求篩檢的民眾時容易無法負荷。
有鑑於上述，張鋒團隊試圖將SHERLOCK應用於此。他們從SARS-CoV-2的基因體中，挑選了S基因和Orf1ab基因作為目標序列，並設計相對應的gRNA以及RPA所需的引子。同時，他們合成這兩個基因的RNA片段，再將它做連續稀釋（serial dilution）以進行後續試驗。根據團隊公布的操作方法（Zhang F et al., submitted），利用SHERLOCK檢測COVID-19僅需三步驟。
事前準備：將檢體經過核酸萃取處理（nucleic acid extraction）。此次實驗並非以病人檢體試驗，而是以稀釋的合成病毒RNA片段，所以無需萃取。
1. 等溫放大（約25分鐘）：利用前述的RPA法提升檢體中的核酸含量。可以使用現成的RPA kit，放在42℃水浴中進行反應。
2. Cas13偵測（約30分鐘）：將T7聚合酶、gRNA、LwaCas13a蛋白質和報導RNA放入第一步處理完的溶液中。均勻混合後，置於37℃水浴。
3. 試紙讀取（約2分鐘）：用緩衝溶液稀釋反應完的溶液，插入專用試紙讀取結果。
結果分析：試紙底部的控制組底線（control band）應該都要呈色。若有偵測到病毒RNA，則會出現兩條線。從圖五可知，如果檢體對於S基因和Orf1ab基因皆呈現兩條線，則代表COVID-19陽性（positive）。
圖五：SHERLOCK 試劑組測試COVID-19之結果示意圖。故事才剛開始－SHERLOCK的未來及挑戰
SHERLOCK相較於傳統的RTPCR在操作上更為簡單、迅速，完全不需要複雜的儀器。若能順利發展，可以讓一般診所即能對COVID-19、登革熱等傳染病進行檢測，減輕大型醫院的負擔，甚至還可以攜帶至醫療資源較匱乏的地區協助控制疫情，如檢疫非洲的伊波拉病毒。
然而，由於SHERLOCK所需的報導RNA及Cas13蛋白價格仍然偏高，如何便宜地大量生產是相當大的挑戰，而成敗的關鍵或許在於：能否使用最少的原料達到足夠的靈敏度及精準度，進而壓低成本。此外，如果要到偏遠地區進行檢疫，如何確保蛋白質及相關試劑在運送過程中不會變質，也會是一大考驗。同時須注意到，若在非最適反應溫度的條件下，RPA是否能維持其專一性？所設計的gRNA是否提供足夠的特異性？所使用的Cas13a是否提供足夠的精準度而不致有脫靶效應（off-target effect）、造成偽陽性（false positive）的檢測結果？這些考量都需要未來以更嚴密的臨床試驗才能進一步確認。
儘管如此，SHERLOCK仍是發展防疫工具的良好研究方向。張鋒的團隊歡迎各界學者與他們聯繫以尋求協助和指導，並願意提供初學者試劑套組（starter kit）以利各方進行測試。期待不久後SHERLOCK能如其名，成為調查基因和病毒序列的大偵探！
參考資料
1. Zhang F, Abudayyeh OO, Gootenberg JS, A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics (submitted, 2020).
2. KS Makarova, YI Wolf, J Iranzo et al., Evolutionary classification of CRISPR–Cas systems: a burst of class 2 and derived variants, Nature Reviews Microbiology, Vol 18: 67-83, 2020.
3. Gootenberg JS et al., Nucleic acid detection withCRISPR/Cas13a/C2C12, Science, Vol 356: 438-442, 2017.
SHERLOCK相關延伸閱讀
McGovern Institute解釋SHERLOCK的影片（三分鐘）SHERLOCK: A CRISPR Tool to Detect Disease.