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傳染病是造成全球疾病和死亡的主要原因之一，而要預防傳染病傳播、提供有效治療，則需要準確、靈敏、方便、廉價和便攜的快速現場診斷。定點照護檢驗（point-care-testing, POCT）〔註〕是指鄰近受測對象所執行的相關測試或檢驗活動，提供即時、準確的診斷結果，對於預防傳染病傳播及提供正確治療方法來說非常關鍵。現階段常見的傳染病檢驗包括抗原－抗體血清反應（antigen–antibody serum reaction），但此方法有時會不夠靈敏、準確；其次則為聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction assay, PCR），可惜不夠快速與方便。幸運地，叢集規則間隔短回文重複序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat, CRISPR）技術有潛力提供一種快速、方便、特異和靈敏地檢測傳染病的POCT。
 

〔註〕隨著檢測技術的蓬勃發展與應用功能的創新，現今醫療單位所提供的檢驗方式已不再侷限於實驗室內。因應醫療環境的變化及疾病預防、治療的需要，快速且在現場進行的POCT檢驗模式也應運而生。根據國際規範ISO 22870的規定，POCT的定義為：「在病患附近或所在處執行的檢驗，結果可能對病患的照護方式產生改變」
 
因此POCT應用於醫療檢驗又稱「鄰近病人的檢驗」（near-patient testing）或「床邊檢驗」（bedside testing）。在疾病的預防和治療上，臨床醫師快速診斷疾病需即時獲得檢驗數據，若循常規模式將檢體傳送到實驗室進行檢驗在時效上可能來不及。而藉由POCT所獲得的即時結果，醫師就可快速提供病患相對應及正確的診斷及治療。因此，POCT應兼具快速、特異、靈敏、便利，以及無須特殊儀器、也無須由專業人員操作等特性。

傳染病檢測的傳統方法

為了避免病原體傳播及快速治療傳染病，使用適當的診斷方法以準確、靈敏及快速的檢驗病原微生物至關重要。病原檢測方法重類繁多，各種實驗室技術包括核酸檢測法（nucleic acid testing），例如南方墨點法（southern blotting）、北方墨點法（northern blotting）、即時定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR）等；以及抗原－抗體血清反應，例如補體結合試驗（complement fixation test）、免疫螢光試驗（immunofluorescent assay）及免疫吸附試驗（immunosorbent assay）等，皆可用於診斷傳染病和病原體（表一）。然而，核酸檢測耗時，需要超過四小時甚至24小時，而且還需要大量工作、設備、儀器和專業人員；而抗原－抗體血清反應的靈敏度和準確性，常有所不足。

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CRISPR技術應用於定點照護檢驗

目前市面上對於同時兼顧靈敏度和準確性，又有便攜、快速這兩者優點的POCT需求量仍相當大。幸運的是，CRISPR技術有潛力用於傳染病檢測，包括多種病原體，顯示它可作為一個快速、便攜、簡單及一次性的POCT平臺。目前已經有多種病原體正在研發階段，舉例說明如下：
 

1.新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）

2020年，中國深圳的研究團隊發表了一種以CRISPRCas12a系統偵測新型冠狀病毒開放閱讀框（open reading frame, ORF）的ORF 1ab和核殼蛋白（nucleocapsid (N) protein）基因的檢測方法。他們結合CRISPR技術與重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification, RPA）快速處理樣品，結果可用肉眼觀察或使用螢光讀數器（fluorescence readout）進行評估。研究人員使用反轉錄定量聚合酶鏈反應（reverse transcriptasequantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）檢測22個臨床檢體，將此結果與CRISPR-Cas12a系統的檢測結果做比較，發現陰性和陽性樣品的檢測結果與RT-qPCR讀數之間均具有100％的一致性，而且可以在50分鐘內獲得結果，且靈敏度高。因此，CRISPRCas12a的診斷方法有機會用於POCT，有助於有效控制COVID-19大流行、提供即時有效治療。
 

2.人類乳突病毒（human papillomavirus, HPV）

去（2022）年來自中國河南鄭州的研究團隊發表以CRISPR-Cas12a/Cas13a雙重系統結合多重重組酶輔助擴增（recombinase-aided amplification, RAA）快速檢測HPV16/18的方法，可用於篩檢子宮頸癌。研究團隊設計了一種便攜式螢光成像測定法，可以直接透過肉眼觀察或手機成像來區分測試結果。研究結果顯示，HPV16和HPV18的檢測極限（limit of detection, LOD）均為1 copy/μL（每微升的複製數），再使用55個臨床檢體驗證該雙重系統後，顯示出97.06％的靈敏度、100％的特異性、100％的陽性預測值和96.55％的陰性預測值。因此，CRISPR-Cas（Cas12和Cas13）系統的檢測有可能成為HPV檢測的POCT，具有快速、便攜、特異、靈敏和準確的特點。
 

3.B型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）

在2021年同樣由中國河南鄭州的研究團隊發表了以環介導擴增（loop-mediated amplification, LAMP）－Cas12a進行HBV的檢測方法。此處採用側流試紙（lateral flow test strip）技術，測試結果肉眼可見的結果；還能以讀取螢光的方式，完成即時高靈敏度檢測。螢光讀數器的Cas12a檢測可在13分鐘內檢測出LOD為1 copy/μL的HBV，而側流試紙條法也僅需20分鐘。研究團隊使用73個臨床檢體進行驗證評估，發現LAMP-Cas12a的檢測（包括螢光讀數和側流試紙條法）的靈敏度和特異性均達到100％。結果顯示使用LAMP-Cas12a的HBV檢測只需最少的設備即可獲得快速、準確的結果，完全可與qPCR相媲美，而且該方法經過不斷改善後，展示出特異性佳及抗干擾性強的特點。

4.C型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）

去年泰國清邁的研究團隊發表並驗證了一種快速、準確的HCV RNA檢測方法，該方法結合RT-LAMP和CRISPR-Cas12a檢測，用於識別HCV特定的RNA序列。研究團隊分別以感染了HCV、HIV或HBV的患者、以及健康人的臨床檢體進行測試。在靈敏度測試的部分，100個已知有感染HCV的血漿檢體中，藉由側流試紙條和螢光讀數器等兩種讀數檢測後，有93個檢體呈陽性；第二次重新檢測後，只有四個檢體保持陰性，也就是說第一輪和第二輪的靈敏度分別為93％和96％。在特異性測試的部分，使用了30個樣本，當中包括HBV感染者HIV感染者、健康者各10位；與對照方法qRT-PCR相比，RT-LAMP結合CRISPR/Cas12檢測的靈敏度和特異性分別為96％和100％，一致性為97％，而檢測到的HCV RNA的LOD為10 ng/μL（奈克／微升），估計為2.38 Log IU/mL〔註〕。因此，RT-LAMP和CRISPRCas12a檢測有機會成為一種經濟實惠且可靠的HCV POCT，在缺乏資源的環境中具有應用潛力。
 

〔註〕國際單位（international unit, IU）是用生物活性或生物效價來表示某些維生素、激素、藥物（例如抗生素、疫苗、血液製劑）及類似的生物活性物質的藥理計量單位。

CRISPR技術進行檢測的前景與限制

CRISPR技術提供一種便攜式診斷方法，結合qPCR和抗原－抗體血清反應快速、準確、特異性和方便等優點，且有些已針對標靶（target）進行嚴格驗證，在檢測各種微生物包括細菌、真菌、病毒和寄生蟲方面顯示出潛力。部分技術不僅處於基礎研究或臨床試驗階段，甚至已進入臨床應用、逐漸商業化，顯示出可作為臨床POCT的前景。例如美國Mammoth Biosciences公司開發的CRISPR-Cas12檢測方法已於去年1月獲得美國食品和藥物管理局的緊急使用授權（emergency use authority, EUA），用於新型冠狀病毒的臨床檢測。然而，將CRISPR技術應用到POCT仍存在一些限制。
 
首先，CRISPR技術的測定雖與抗原－抗體血清反應一樣可用肉眼區辨，但這只是估計結果，而不是精確結果。另一方面，相較於qPCR反應，CRISPR技術檢測的特異性和準確性雖然相近，但結果只是半定量的，不能如qPCR反應提供檢測的循環數閾值（threshold of cycle, Ct）作為定量參考。此外，CRISPR技術的檢測極限較高，因此靈敏度低於qPCR反應，且檢測所獲數據並不是線性的，如果想獲得更精確的結果，仍需要進行qPCR來作雙重驗證和確認結果。因此，有必要再降低檢測極限，並持續探索使用CRISPR技術檢測的數據線性關係。
 
其次，並非所有病毒體的檢測標靶基因，也就是特定的DNA/RNA序列都可以輕易被篩選。為了保持檢測穩定性，需要選擇不易突變的標靶基因，例如CRISPR技術的檢測中，通常選擇新型冠狀病毒的N基因和／或E基因作為COVID-19檢測標靶，因為它們比S基因更穩定。但選擇合適的標靶基因相當麻煩且困難，有時甚至幾乎不可能。此外，用於檢測的標靶基因只是相對穩定，並非真的永久不變；因此為了確保CRISPR技術的檢測準確度、精密度和穩定性，可能需要定期檢測，以了解標靶基因的穩定性。
 
最後，精確設計高度特異性和高效的CRISPR RNA （crRNA）和等溫引子（isothermal primer），對於CRISPR技術的臨床應用至關重要，設計過程需要密集的管理和嚴格的參數，以最大限度地減少脫靶檢測。因此，有必要開發單一且簡化的生物資訊平臺，協助快速設計用於CRISPR平臺的crRNA。幸運的，目前已出現PrimedSherlock平臺，已經開發出來一種自動化的計算機引導流程，用於選擇針對標的基因具有高度特異性的crRNA和引子，可以顯著提高CRISPR技術的檢測效率。
 

具POCT潛力的CRISPR技術

傳染病和病原體的早期檢測對於有效的疾病治療、控制和預防至關重要。目前，核酸檢測和抗原－抗體血清反應是檢測傳染病最常用的兩種方法。前者準確度高、特異性強、靈敏度高，但耗時長、成本高，並對技術人員和設備、儀器有特殊要求；後者快速且方便，但準確性和靈敏度可能不夠。因此，開發快速、現場的即時診斷測試是必要的，以實現準確、靈敏、方便、廉價、便攜性的傳染病臨床檢測。CRISPR技術檢測的強大能力將促進POCT診斷工具的進一步發展，儘管目前此法仍然存在一些限制，但長期而言仍有潛力作為當前傳統檢測的替代方法或另一種選擇。

 
延伸閱讀
1. Xiong, D. et al. (2020). Rapid detection of SARS-CoV-2 with CRISPRCas12a. PLoS biology, 18(12), e3000978.
2. Zheng, X. et al. (2022). Rapid detection of HPV16/18 based on a CRISPR-Cas13a/Cas12a dual-channel system. Analytical Methods, 14(48), 5065-5075.
3. Ding, R. et al. (2021). CRISPR/Cas12-based ultra-sensitive and specific point-of-care detection of HBV. nternational journal of molecular sciences, 22(9), 4842.