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2021-02-18CRISPR技術在基礎研究及農產品、食品生產上的應用
470 期
Author 作者
陳淵銓／美國加州大學柏克萊分校生物化學博士。
CRISPR技術已廣泛用於基礎研究，包括生物體的基因轉殖、動物模式的建立及輔助工具的發展等，顯著加快並簡化這些相關應用的發展。此外，隨著CRISPR技術逐漸成熟精進，亦成功應用於生產農產品及食品，已顛覆傳統農產品及食品的生產方式，並具潛力大幅改善相關產品的品質及產量，有助人類營養水準及生活品質的提升。
生物體基因選殖
傳統的基因選殖方法使用限制酵素（restriction enzyme）切割特定基因組限制位置（restriction site），選定基因後切割位置精準度不足，篩選耗時費事，成本難以估計。
基於CRISPR技術執行生物體的基因編輯較傳統方法具有高效率、準確、迅速及經濟等優點，科學界早已利用此技術改造生物體基因，製作了許多基因轉殖動物（transgenic animal）、植物或微生物應用於基礎研究，包括：病毒、細菌、酵母菌、原生動物、植物、老鼠及人類細胞等，是目前最成功且最廣泛的應用方式。
模式動物建立
模式動物（animal model）係指在某種動物自發或經人為誘導而產生特定的疾病或生理反應，若與人體有類似生命現象，則應用該種動物作為「模式」以瞭解人類罹患此疾病或發生該生理反應的機制。
人類疾病具多樣性，並非在所有動物身上都可產生與人類相似的疾病，所以如何選擇最合適的動物及使用何種方法去建立模式動物十分重要。很多疾病的研究原本沒有適當的實驗動物可供採用，CRISPR技術開發後，科學家可依需求快速的開發模式動物。成功案例包括：
（1）基因編輯豬（piglet）：研究糖尿病（diabetes mellitus）的胰島素INS基因剔除突變小豬。
（2）基因編輯小鼠（mouse）：研究遺傳性疾病囊狀纖維化（cystic fibrosis）的G542X基因無意義突變（nonsense mutation）小鼠；肥胖（obesity）及糖尿病的瘦素（leptin）、瘦素接受體（leptin receptor）的基因剔除突變小鼠；帕金森氏症（Parkinson's disease）的突觸核蛋白（alpha-synuclein,SNCA）基因突變小鼠。
（3）基因編輯兔（rabbit）：研究人類體染色體隱性遺傳疾病肌肉營養不良症（muscular dystrophy）的ANO5基因剔除突變兔子。
（4）基因編輯大鼠（rat）：研究甲狀腺低功能症（hypothyroidism）的甲狀腺刺激素接受體（thyroid stimulating hormone receptor,TSHR）突變大鼠（TshrDf/Df rat ） ； 神經退化性疾病（neurodegenerative disease）如帕金森氏症、阿茲海默症（Alzheimer's disease）及亨丁頓舞蹈症（Huntington's disease）的突變大鼠。
輔助工具發展
CRISPR技術的快速發展需要簡便、低成本、高效益、可靠及穩定的輔助工具。使用CRISPR技術進行研究時，須使用許多試劑和周邊設備，包括成套工具組、鑑別酵素及次世代定序分析（next generation sequencing, NGS）儀器等。前二者可用來鑑定CRISPR/Cas9作用的準確性（accuracy）及切割效率（cleavage efficiency）；NGS可以用來鑑別脫靶效應的類型：野生型（wild type）、刪除（deletion）、置換（substitution）或嵌入（insertion）等突變型，以及各類型分別占有的比率。
CRISPR輔助工具也向生物資訊領域發展，功能強大且成本效益高的軟體成為開發的新目標。在2018年，美國加州有一家基因工程公司，推出軟體ICE（Inference of CRISPR Edits）分析基因編輯的結果。這個新工具能在幾秒內經由桑格（Sanger）的定序數據取得與NGS相同品質的結果，除了可以同時分析數百個樣品，且價格還比NGS低100倍。因為ICE是免費且開放的，亦能批量處理桑格數據，所以研究人員便能藉此分析軟體快速獲得穩定的編輯分析結果，具有成為CRISPR分析標準的潛力。此外，ICE與CRISPR evolution合成引導RNA（guide RNA）系列可以提供點對點（end-to-end）的解决方案。
農作物的改良
傳統育種法（conventional breeding）是在植物自發性突變（spontaneous mutation）後，以人為的方式（人擇）從自然界中挑選出具有特定表徵的變異植株，再經過反覆的雜交（hybridization）與回交（backcross），篩選出穩定表現特定性狀的農作物，特性如產量高、風味佳、抗病力強或栽培易等；最後進行大量培育，生產糧食。但這種方法的效率極低，必須將時間拉長到十年、百年、甚至千年，才能產生可觀的效果。
傳統育種法除了需時甚久外，產生的特定性狀變異植株也未必能夠符合人類的需求。由於氣候變遷及全球暖化的影響，地球上許多農耕區域溫度升高且越來越乾燥，使得農作物的種植更為困難，再加上害蟲的侵襲或傳染疾病的散播，使得單位面積農產品產量下降。人類需要培育能抗惡劣環境、抗蟲害、抗疾病、抗除草劑及產量高的農作物，如稻米、玉米、阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）、菸草及蕃茄等，以確保糧食的供應無虞，或者開發比較不易腐爛、可儲存較久及便於運送的蔬果。
基於CRISPR編輯基因的高效率及準確性，使用此技術改良農作物成為一個絕佳的選擇，可以使農作物種植具有更高的效益，緩解主要糧食的短缺，亦可創造出不受環境影響的農作物，而且可能會含有更多營養物質或有更長的保存期限。
優化畜產品
CRISPR技術在家畜（禽）育種扮演了重要的角色，透過基因編輯改變家畜（禽）的性狀以符合人類的需求，使動物育種向大規模化及多基因改良的方向發展，提高人類的營養水平和生活品質。
在2017、2018年，中國研究人員使用CRISPR技術對豬和牛的肌肉生長抑制素（myostatin, MSTN）進行基因編輯，改造後的MSTN基因在細胞培養及胚胎中可抑制肌細胞的增殖與分化，引起動物表現「雙肌」性狀（double-muscling phenotype），如明顯的肌肉突出物、較寬的背部或臀部等，可促進動物產生更多的肉，對豬、牛等肉用家畜的培育有極大幫助。
在2017年，中國研究人員利用CRISPR技術標靶作用在山羊胚胎纖維母細胞，成功剔除了羊奶過敏物質── β-乳球蛋白（β-lactoglobulin, BLG）的基因，並發現在基因轉殖山羊體內的乳球蛋白幾乎完全消失，顯著提高了羊奶的品質，有潛力進一步作為醫療和農業研究之用。
這些基因編輯動物的突變類型是在自然界是存在的，並已用於畜牧業生產。因此，使用CRISPR技術模擬自然突變產生的高產能及高品質的動物容易被大眾接受。
水產品改造
鮭魚是眾所皆知的味美又營養成分豐富的高經濟魚類，但野生鮭魚生長期長，捕捉具有季節性，產量起伏很大，很難估計是否足以供應所需。美國食品藥物管理局在2015年11月核准了第一個作為人類食物的基因改造鮭魚，這種基改鮭魚生長快速，可圈養大量繁殖供應人類食用。
美國科學家鄧納姆（Rex Dunham）在2017年成功利用CRISPR技術標靶作用在鯰魚胚胎的肌肉生長抑制素（MSTN）基因，結果發現長成的鯰魚平均體重增加29.7％，大幅增加了美國漁業養殖業的鯰魚產量。為了避免基改魚類如果逃至野外，將會破壞生態平衡的情況。然而如果基改魚可達到100％絕育，即使逃離也無法在自然界繁殖，那麼對生態就不會有
任何影響。鄧納姆以鯰魚作為研究對象，使用CRISPR技術成功地抑制了三個生殖激素基因，必須經過特定處理後，才可進行繁衍，同樣的方法亦很有潛力應用在不同種的魚類。
用於食品生產的微生物
製造食品所涉及的各類微生物如發酵菌、益生菌、腐敗菌及食源性致病菌等，都可以使用CRISPR技術加以改造，經基改過的微生物生產效率較高，除可提升品質及產能外，還可節省成本。
許多食品的生產依賴微生物的發酵作用，但微生物（如細菌、真菌等）遭受病毒或噬菌體的感染後，生長或代謝亦會受到影響，輕則產能降低，重則死亡無法作用，這對食物業造成的衝擊是很大的。例如：嗜熱性鏈球菌（Streptococcus thermophilus）主要是用來生產優酪乳（yogurt）或起士（cheese），當嗜熱性鏈球菌受到噬菌體的感染後，將嚴重影響產品的生產。
在2007年，美國杜邦公司（DuPont）使用CRISPR技術改造嗜熱性鏈球菌的基因組，使其成為噬菌體不敏感性突變株（bacteriophage-insensitive mutant）而免受侵襲，解決嗜熱性鏈球菌受到噬菌體感染而降低或失去產能的問題。
CRISPR技術可以產生產基因改造生物體（genetically modified organism, GMO），食品業者可以藉此技術大量生產GMO食品，例如：不會褐變的洋菇（Agaricus bisporus）、更細嫩的肉品及更可口的高麗菜等。其中洋菇是近年獲得美國農業部核准通過的30個GMO之一。在2016年，美國科學家利用CRISPR技術切除6個會導致洋菇褐變的多酚氧化酶（polyphenol oxidase, PPO）基因其中的1個，而降低了約30％的PPO活性。這個作法被核准可能與不使用外來基因有關，操作模式為「破壞現有基因」而非「加入外來基因」，如果蔬菜、水果等食品能在切開後仍保持色澤，並延長保存期限，確有其實際需要及營養價值。
在臺灣，已有很多實驗室使用CRISPR技術於基礎研究，如建立實驗動物模式、可用生產農作物的基因轉殖植物、畜產品的基因轉殖動物及生產食品的微生物基因改造等。統計近5年科技部補助的CRISPR專題研究案顯示，相關研究計畫包括以CRISPR產製抗生殖呼吸道綜合症候群的基因編輯種豬、編輯水稻基因使之成為抗除草劑品種、提昇微藻固碳效能、開發CRISPR和CRISPRi（CRISPR interference）混成系統應用於大腸桿菌生產琥珀酸，及利用CRISPR基因編輯庫建立永續酵母菌細胞工廠等。
這些研究有些仍在進行中，有些成果則已發表於學術性專書、期刊或研討會論文。雖然大多數研究成果僅止於實驗室或田間試驗階段，但是以目前技術進步的速度來看，相信在不久的將來製造出來的產品是有可能被實際應用的。
延伸閱讀
1. Tim Hsiau, et al., Inference of CRISPR edits from sanger trace data. BioRxiv , (2018)
2. Karim Khalil, et al., Generation of myostatin gene-edited channel catfish (Ictalurus punctatus) via zygote injection of CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports, (2017)
3. Emily Waltz, Gene-edited CRISPR mushroom escapes US regulation. Nature News, (2016)