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1990年，科學家首次將mRNA注入小鼠肌肉中，發現肌肉細胞成功地將mRNA轉錄為有功能的蛋白質；但由於人體的免疫機制，外來RNA很快地被排除，更可能引起劇烈的發炎反應。卡林科（Katalin Karikó）的研究團隊發現，特定核苷酸修飾能降低免疫細胞的活化程度，若人工合成的mRNA上帶有足量的核苷酸修飾，就能讓細胞不排斥外來mRNA，細胞便會乖乖地照著mRNA，做出我們心中的蛋白質。

 
去（2020）年末，當2019冠狀病毒疾病（COVID-19）流行近週年時，由輝瑞（Pfizer）、莫德納（Moderna）研發出的mRNA疫苗橫空出世，其保護力令人驚艷。然而，mRNA疫苗的緣起，要從30幾年前，一名女科學家的故事開始講起……。
 

過於脆弱的mRNA，被科研拋棄的孤兒

試想，若能控制蛋白質，我們就能治癒很多疾病，如教白血球認識腫瘤抗原，便能殺滅腫瘤細胞、治癒癌症，像是黑色素瘤；又或是讓身體自行產生正常蛋白質，就可以取代缺陷蛋白、治癒遺傳疾病，例如B型血友病。
 
但人體是個討厭外來物的組織，若是直接注射蛋白質到體內，可能會引起發炎反應。而在藥廠裡，想要完美模仿細胞，生產、純化複雜且分子量巨大的蛋白質，卻又過於昂貴、困難，這該怎麼辦呢？嗯，我們可以試試教細胞自己做蛋白質啊！
 
細胞就像中央廚房，遵守著DNA主廚的指令，主廚（DNA）寫出食譜（mRNA），再由細胞廚房依食譜烹調出料理（蛋白質），由也就是「DNA→mRNA→蛋白質」的流程，此流程稱為中心法則（central dogma）。舉例來說，COVID-19疫苗的原理是讓人體內出現病毒蛋白，因此科學家可採取兩種方式，分別是：
 
．讓人工DNA進入細胞，例如腺病毒（Adenoviridae）載體技術（牛津疫苗等）。
．讓人工mRNA進入細胞，例如mRNA疫苗（輝瑞疫苗等）。
 
mRNA療法最初的曙光出現在1990年，當時科學家首次將全裸、無任何保護的mRNA注入小鼠肌肉中。他們並發現，小鼠的肌肉細胞能成功將mRNA轉譯（translation）為有功能的蛋白質，並持續了生產18個小時。然而，科學家也很快認清事實：mRNA療法雖然理論上可行，但實際實行上卻有著巨大的阻礙。如同前面提到的「人體是個厭惡外來物的組織」，它討厭外來的蛋白質──也討厭外來的mRNA。
 
由於人體不希望細菌或病毒侵入體內，所以身體具備多種優秀的系統，能夠隨時隨地排除外來的RNA。像是在細胞外有豐富的核糖核酸酶（RNAse）可以分解RNA；更糟的是，細胞的類鐸受體（Toll-like receptors, TLRs）系統，能偵測可疑的RNA，辨認出這個可疑的RNA屬於外來基因，因此判定細胞正被病毒感染，於是便關閉這些RNA的轉譯作用，更會引起劇烈的發炎反應。人體天然的防禦系統，對mRNA療法而言，不僅導致轉譯效益低下，更可能對病人的健康造成傷害。
 
幾近完美的人體免疫系統，讓mRNA療法被打入冷宮、沉寂多年，直到一名女科學家出現。

降職、罹癌，依舊沒有放棄的女科學家—卡林柯

1985年，當時30歲的匈牙利科學家卡林柯（Katalin Karikó），帶著丈夫與2歲的女兒，以及縫著1200元美金的泰迪熊，飛往美國展開研究職涯。卡林柯深信mRNA療法的可行性，持續地申請mRNA療法計畫的研究經費。然而當時學界普遍認為RNA過於脆弱，且它誘發的發炎反應過於強烈，不可能會有希望，因此她的計畫一再地被高層否決。在缺乏資金和研究成果的情況下，卡林柯在1995年被大學降職，同時間她被診斷出罹患癌症；而丈夫也因為簽證的關係必須滯留海外，只能和她相隔千里。在健康、職場、家庭遭遇到的三重打擊，考驗著卡林柯對mRNA療法的信心。
 
她回憶起當時的想法：「我想，也許我還不夠聰明、不夠好。我試著這麼告訴自己：每件事都已經到位了，我只需要做出更出色的實驗就可以了！」而在三年後，因為共用一台影印機，卡林柯認識了研究HIV疫苗的同事魏斯曼（Drew Weissman），兩人一同埋頭研究著mRNA療法。直到2005年，研究終於露出重大突破──他們找到不會引起發炎反應的RNA了！
 

不會引起發炎反應的關鍵結構？

科學家很早就發現，核苷酸（DNA或RNA）會活化免疫系統，引起發炎反應，但令人困惑的是，動物細胞裡也有豐富的核苷酸，為什麼不會活化免疫細胞呢？以DNA來說，直到上個世紀末，人類才發現原來DNA的序列和微結構，會觸發特定的細胞訊號，例如DNA的CpG序列裡，較少的甲基化（methylation）修飾，會活化免疫細胞的第九型類鐸受體〔註〕，研究者推測這可能是因為細胞認為此特徵符合原核生物的DNA，因此會啟動發炎反應、排除入侵者。根據此概念，團隊展開了精彩的思辨和實驗設計，他們假設：「既然DNA如此，那麼RNA的免疫反應，會不會也受核苷酸的亞型（A、U、G、C以外的核苷酸）與微結構影響呢？」
 

〔註〕被免疫系統判定疑似細菌DNA的CpG序列，由於它可以引起發炎反應，所以反倒在疫苗領域被作為佐劑使用。如國產高端疫苗，其佐劑就是使用CpG序列。

 
他們回顧文獻時，發現在科學家已知的RNA裡，核苷酸的亞型與被修飾（如甲基化）的比例，似乎隨著生物演化而逐漸不同。以核醣體RNA（rRNA）為例，哺乳動物rRNA裡的偽尿苷（pseudouridine, Ψ）比例是細菌rRNA的10倍；而轉移RNA（tRNA，負責攜帶胺基酸、辨認mRNA的零件）在哺乳細胞有高達25％的核苷酸被修飾，比例遠高於原核生物；相較於毫無修飾的細菌mRNA，哺乳動物mRNA的5’端帽（5’cap）修飾，則有形形色色的核苷酸亞型，像是m5C（5-methylcytidine）與m6A（N6-methyladenosine）等。細菌和動物RNA微結構 的差異，也讓卡林柯團隊能試圖釐清RNA亞型和免疫反應之間的關係〔註〕。
 

〔註〕有趣的是，許多病毒（如流感、腺病毒、單純皰疹等）的RNA也有大量的修飾。這此現象暗示這些病毒和人類共存極久，可能從我們的細胞偷學了這招，以更好地模仿宿主特徵，騙過我們的免疫系統。

向細胞學習，天然的免疫逃避

科學家分離出細胞內不同的RNA，分別為rRNA、mRNA、tRNA、粒線體RNA等，餵給免疫細胞如樹突細胞（dendritic cell），並觀察不同的RNA是否會引起不同程度的發炎反應。結果發現，哺乳細胞的rRNA、mRNA會誘發些微的發炎相關因子（TNF-α）；粒線體RNA會引起劇烈的發炎反應〔註〕；而核苷酸修飾比例最高的tRNA，則幾乎不會活化免疫細胞。
 

〔註〕粒線體是古代細菌殘留在我們體內的痕跡。

 
為了確認何種核苷酸的修飾，能避免活化免疫細胞，科學家合成了多種RNA，其中的核苷酸分別由偽尿苷、m5C、m6A等取代，再將眾多人工RNA和人體的樹突細胞混合。結果顯示，特定的核苷酸修飾，如偽尿苷等，能降低免疫細胞的活化程度。也就是說，若要打造出不會引起人體發炎反應的mRNA療法，關鍵就在於讓人工合成的mRNA，有足量的修飾核苷酸，讓細胞受器誤以為這是「自己人」，然後細胞就會乖乖地照著mRNA、做出我們心中的蛋白質了！
 
隨後，卡林柯團隊將帶有核苷酸修飾的螢光蛋白mRNA，注入小鼠靜脈。他發現，若注射的是有核苷酸修飾的人工mRNA，小鼠體內的發炎因子都遠低於無修飾的組別；更重要的是，在動物脾臟裡檢測出高量的螢光蛋白及更穩定存在的mRNA。動物實驗的結果同樣顯示，核苷酸修飾mRNA技術，能有效降低發炎反應、大幅提高轉譯效率和穩定性的優勢。
 
此刻開始，卡林柯真的做到了她當年心中所想的「更出色的實驗」！即使在人生低潮時，她也沒有放棄的mRNA療法，逐步向治療癌症、罕病的目標挑戰。而他們做出的研究結果更在數十年後，一躍成為拯救世界、終止COVID-19疫情的mRNA疫苗。
 

從實驗可行到正規醫療手段

卡林柯與魏斯曼的研究，幫mRNA療法開啟了綠燈，也吸引了更多科學家，持續地最佳化mRNA療法，如：
 

提升轉譯效率

最佳化mRNA的5'端帽（5’ cap）、5'-和3'-非轉譯區（untranslated region, UTR）、多聚腺苷酸尾（poly-A tail）等部位，並增強mRNA在細胞內的穩定性和轉譯效率。像是在5’端帽模仿真核生物的m7GpppN〔註〕結構，或開發新的微結構；在特定療法設定最佳的多聚腺苷酸尾鹼基長度等。這些技巧讓mRNA在細胞內能存活更長的時間，產出更大量的蛋白質，使得在臨床現場中，需要的mRNA量更少，大幅地增加了未來mRNA療法成為正規醫療的可行性。
 

〔註〕在真核生物mRNA鏈第1個鹼基的前方，尚有個以3個磷酸聯結的鹼基（G），被稱為5'端帽。若缺乏此修飾，mRNA在細胞內會快速被降解。

最佳化載體

儘管病毒載體，例如慢病毒（lentivirus）也能投遞mRNA，但白血球對病毒外殼的免疫反應，仍令人卻步。而早期的投遞技術通常使用正電脂質吸附與保護mRNA，但它的肝臟毒性使它逐漸被棄用。目前研究單位逐漸轉向改用pH敏感性脂質，在中性的生理環境下可保持電中性、降低毒性；當pH敏感性脂質被細胞吞噬，進入溶體（lysosome）後，會因pH值降低而重新帶電，進而逃脫溶體。
 
而在COVID-19疫苗的開發中，從mRNA療法延伸出的mRNA疫苗和其他技術比較，更展現了無可取代的優異性：
 

開發／改良速度

和腺病毒載體類型疫苗，如牛津疫苗比較起來，mRNA疫苗無須進行細胞培養和純化病毒，整體更快速、安全；而和蛋白質類型疫苗，如Novavax、高端疫苗比較，mRNA疫苗能直接讓細胞產出病毒棘蛋白，不需要煩惱蛋白質在剪接（splicing）、摺疊（folding）、醣化（glycation）等轉譯後的修飾，生產上更加迅速。從病毒基因序列公布的那天算起，莫德納僅花了25天就完成了疫苗。而面對各地的變異株病毒，輝瑞疫苗表示僅需6週，就能完成針對變異株病毒改版的新劑型。mRNA療法的驚人開發速度展露無疑。
 

安全性

mRNA在人體內分解速度快，安全性高，由於未採用DNA，能減輕民眾對於疫苗是否會插入人體基因的疑慮。
 

接近自然感染

和蛋白質類型疫苗比較，mRNA疫苗更接近病毒自然感染細胞的過程，讓細胞表面布滿病毒棘蛋白，能有效刺激細胞免疫（cellular immunity）反應。
 
從卡林柯飛往美國那天開始，她已經在mRNA療法領域耕耘數十年。誰也沒想到，她當初的堅持與科學界的棄兒，至今已成了拯救世界、終結大規模傳染病的關鍵技術，未來更可能戰勝癌症、克服罕病。現在不少人都認為她的卓越表現，應得到諾貝爾獎的讚賞。你認為呢？

 
延伸閱讀
1. Katalin Karikó et al., Suppression of RNA Recognition by Toll-like Receptors: The Impact of Nucleoside Modification and the Evolutionary Origin of RNA, Immunity, Vol. 23(2): 165–175, 2005.
2. Ugur Sahin et al., mRNA-based therapeutics — developing a new class of drugs, Nature Reviews Drug Discovery, Vol. 13: 759–780, 2014.
3. Katalin Karikó et al., Incorporation of Pseudouridine Into mRNA Yields Superior Nonimmunogenic Vector With Increased Translational Capacity and Biological Stability, Molecular Therapy, Vol. 16(11): 1833-1840, 2008.