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2021-04-15蛋白質加上昆蟲和樹皮！諾瓦瓦克斯（Novavax）疫苗原理與臨床試驗成果
472 期
Author 作者
蔣維倫／泛科學PanSci專欄作家、故事專欄作家、udn鳴人堂專欄作家、前國衛院衛生福利政策研究學者。喜歡虎斑、橘子、白底虎斑和三花貓。
2021.06.15作者補充：諾瓦瓦克斯（Novavax）於2021年5月14日發布預印本於medRxiv。由英國約一萬五千名受試者結果顯示，諾瓦瓦克斯疫苗保護力約89.7%（有症狀感染），若檢視α變異株（B.1.1.7，英國）的保護力則約86.3%。 而在不良反應中，其發燒、頭痛、疲倦之比例，皆比莫德納（Moderna）、牛津／阿斯特捷利康（AstraZeneca, AZ）疫苗少。 此結果帶給人類極大的希望，諾瓦瓦克斯可望成為COVID-19的疫情裡，第一支蛋白質類型的疫苗。
對抗COVID-19的疫情，疫苗研發眾所矚目。已問世的COVID-19疫苗已有mRNA、腺病毒等類型，尚有一個重要的類型──蛋白質疫苗尚在研發階段。蛋白質疫苗的使用相當廣泛，如：B型肝炎、HPV疫苗，都是注射病毒的蛋白質，引起免疫反應。此類型疫苗特別適合「病原體難以培養」、「對疫苗內含DNA或RNA有疑慮」等情況。
這次的COVID-19疫情裡，諾瓦瓦克斯（Novavax）率先完成了蛋白質類型疫苗的三期臨床試驗。本文即著重介紹諾瓦瓦克斯疫苗的發展與特色。
剛開始的時候，疫苗分成兩派……
疫苗從18世紀末，第一支牛痘疫苗由詹納（Edward Jenner）種下，一路發展至兩次世界大戰期間，疫苗內含物主要發展成兩種來源，分別是「弱化的活病毒」活性減毒疫苗（live attenuated vaccines）和「死病毒」不活化疫苗（inactivated vaccines）〔註〕。
• 活性減毒疫苗：盡可能地接近「自然感染→白血球看到病毒」，讓模擬野生病毒的遺傳物質進入細胞，竊取轉錄、轉譯程序，在細胞表面產出關鍵的病毒蛋白。白血球看到散布在細胞表面和體液裡的病毒蛋白，辨認病毒蛋白、啟動免疫反應。
• 不活化疫苗：僅擷取「自然感染→白血球看到病毒」的後半段，讓死掉的病毒注射到人體。白血球看到散布在體液裡的病毒，辨認關鍵的病毒蛋白、進而啟動免疫反應。
發展「死病毒」策略，是因為面對高毒性、高度致殘性病毒時，若選擇「弱化的活病毒」策略，將活病毒打進人體，風險仍然過高。然而，即使採用「死病毒」方針製作疫苗，仍發生過慘烈的醫療事故：1955年的「卡特疫苗事件」（Cutter Incident）。當時卡特製藥廠製造預防小兒麻痺的沙克疫苗，生產發生失誤，疫苗中混入活病毒，最終導致200名兒童癱瘓、10人死亡。
使用病毒製造疫苗隱藏的高度風險，讓科學家重新思考製作疫苗的策略。其中一個思路在於白血球並非辨認整顆病毒，而是分別辨識多個病毒蛋白、進而各自發展對付它們的抗體。若選出最關鍵的病毒蛋白製作疫苗，以此刺激免疫系統產生高濃度抗體並且能有效中和病毒，也就能達到原本的目的。如此不使用完整病毒，只注射關鍵蛋白的「極簡風」設計，不就是科學家心中完美的神兵利器了嗎？
事情當然沒有這麼簡單（泣）
加入「佐劑」增強蛋白質疫苗的效力
最早期從事相關研究的科學家發現，「極簡風」設計的疫苗，無法引起足夠強的免疫反應。原因可能在於純粹的病毒蛋白，無法完整模擬「病原體入侵者」的樣貌，也無法模擬「細胞正遭受感染破壞」的警告訊息，因此不足以誘發出理想中的免疫強度。
因此，疫苗需要佐劑（adjuvant）的幫忙。
1924年，法國巴斯德研究所的拉蒙（Gaston Ramon）觀察發現，生產白喉、破傷風毒素抗體用的馬匹，若注入毒素的傷口化膿，那麼馬兒體內的抗體反而比較高。然後他嘗試著把麵包屑、木薯粉、澱粉等一起打打看，發現能引起局部發炎的物質，能有效促進抗體的產生。而1926年，英國的格蘭尼（Alexander Glenny）發現明礬（鋁鹽化合物）也能提升抗體產生的效益。1932年，鋁鹽化合物正式成為疫苗的佐劑，並持續使用至今。現行HPV疫苗、中國科興COVID-19疫苗也用鋁鹽作為佐劑。
佐劑對疫苗設計、公衛政策有著無可撼動的重要地位。優秀的佐劑能夠降低疫苗裡病毒蛋白的用量，減輕製程壓力、加速疫苗生產速度。且部分族群如：嬰幼兒、老年族群等，其體質較難被誘發出保護力，而佐劑的使用，可較安全地提高體內抗體的濃度。
佐劑歷經近百年的研發，功能可分為三類，分別是讓局部組織發炎／受損（damage-associated molecular patterns-type adjuvants,DAMP）、模仿病源體入侵的訊號（pathogen-associated molecular patterns-type adjuvants, PAMP），和讓白血球更有效地捕獲疫苗（particulate adjuvants）等類型。現代的佐劑通常會混合多種功能，讓疫苗的功效極大化。
那本文的主角，COVID-19的疫苗呢？
諾瓦瓦克斯疫苗的研發
在COVID-19疫情之下，多數疫苗公司鎖定的抗原，都是冠狀病毒SARS-CoV-2的棘蛋白（spike protein），而專門研發蛋白質類型疫苗的諾瓦瓦克斯亦是如此。
從本世紀初的SARS災難後，科學家開始研究冠狀病毒。從病毒對人類細胞的感染史中發現，棘蛋白和細胞表面受器結合後，結構將產生變化，進而融合病毒外膜和人類細胞膜、達到病毒入侵細胞內的目的。而依據對過往冠狀病毒如：HKU1-CoV，SARS-CoV和MERSCoV的研究，科學家觀察到，融合前（prefusion conformation）的棘蛋白結構，將可誘發動物體內更高的抗體 。因此融合前的棘蛋白非常有機會就是COVID-19蛋白質疫苗的最佳抗原選擇。
但是，棘蛋白若單獨存在，融合前結構並不穩定，容易自然形變、被酵素分解。因此，少數COVID-19疫苗設計抗原選擇了棘蛋白，會對其中的胺基酸進行修飾。如諾瓦瓦克斯疫苗將K986和V987都改成脯胺酸（P），讓融合前的結構更穩定，也將原先容易被酵素分解的位置改為682-QQAQ-685，賦予抵抗酵素分解的特性。此類修飾希望讓疫苗的棘蛋白，在人體內維持穩定的融合前形態，以期刺激人體內抗體產生最大化。而諾瓦瓦克斯的科學家，測試了超過二十個版本的棘蛋白，終於找到結構最穩定的胺基酸序列，就此，準備進入下個階段──大量生產。
輝瑞－BNT（Pfizer/BNT）、莫德納（Moderna）、諾瓦瓦克斯（Novavax）和高端（Medigen）之抗原胺基酸序列。圖／作者厲害的大學同學
蛋白質疫苗的大量生產
要大量生產蛋白質疫苗，在優化目標病毒蛋白質形態後，下一個階段便是大量地生產該蛋白質。曾有一度此類蛋白來源，是從患者體內萃取，但因安全性、穩定性等因素，逐漸轉向採用其他生物細胞大規模生產。蛋白質生產最常見以酵母菌培養，而部分疫苗選用了動物──昆蟲細胞來進行培養，代表案例便是葛蘭素史克（GlaxoSmithKline, GSK）的HPV疫苗保蓓（Cervarix），和諾瓦瓦克斯的COVID-19疫苗。
生產諾瓦瓦克斯疫苗的關鍵病毒蛋白質細胞株（Sf9），來自於一種臺灣近年來熟知農業害蟲──秋行軍蟲（Spodoptera frugiperda）的卵巢。科學家確認目標蛋白質後，將修飾後穩定態的融合前棘蛋白的基因， 剪輯入桿狀病毒（Baculovirus），再以帶有此基因的病毒感染秋行軍蟲細胞。至此，農業害蟲搖身一變，就成了生產疫苗關鍵抗原的最強供應商了。
秋行軍蟲細胞產生了棘蛋白後，科學家將其與奈米粒子混合，形成一顆顆大小約30∼40奈米（nm）、表面釘滿棘蛋白的奈米粒子。過往的研究發現，模仿病毒的奈米顆粒（virus-like nanoparticles, VLPs）設計，能提升細胞的吞噬作用、增加抵達淋巴組織的效益。
而如前所述，蛋白質類型疫苗的設計裡，另一個關鍵是佐劑系統。常見的佐劑有：鋁鹽化合物（如保蓓HPV疫苗）、核酸（如高端COVID-19疫苗）等。而諾瓦瓦克斯疫苗的佐劑來源則是樹皮，更精準的說法是皂樹（Quillaja saponaria）的樹皮萃取物──皂苷（Saponin）。
皂苷同時帶有親水和疏水端，所以曾被用於清潔當肥皂用，現在主要用於疫苗和食品添加劑中。皂苷屬於讓局部組織發炎／受損類佐劑，同時能和抗原呈現細胞（antigen-presenting cell, APC）中的樹突狀細胞（dendritic cell）表面受體結合、活化樹突狀細胞；且能協助病毒蛋白質透過第一型MHC（MHC class I）來呈現抗原，進一步誘發免疫力。諾瓦瓦克斯將皂苷、膽固醇和磷脂質混合，組成了大小約40奈米的粒子，作為Matrix-M佐劑系統，並期許能在COVID-19疫苗的使用上，達到用更少的抗原、獲得相同強度免疫力的效果 。
（參考資料：Dai & Gao (2021) ）
最終獲得的蛋白質疫苗編號 NVX-CoV2373，通過了高溫、極限酸鹼、攪拌等惡劣環境考驗，依舊保持優秀的穩定性。就此，準備進入下個階段──動物實驗。
諾瓦瓦克斯分別於受試的獼猴接種了低／中／高濃度抗原（每劑2.5／5／25 μg）。測試其血清抗體對活病毒的辨認能力；同時刻意讓獼猴感染，再觀察上、下呼吸道的組織切片。
動物實驗結果顯示，接種諾瓦瓦克斯疫苗後，獼猴體內抗體能有效中和病毒。而在感染後，病毒對肺臟損傷層面，安慰劑組出現中至重度的發炎情況、血管週邊和肺泡皆有白血球聚集，顯示病毒感染對獼猴的肺臟產生傷害；而在低、中濃度抗原的動物中，觀察到中度至輕微的發炎反應，在高濃度抗原組裡，支氣管、肺泡和血管都顯示正常。
冠狀病毒表面的棘蛋白，是研發蛋白質疫苗的重要標地。（NIH）
諾瓦瓦克斯臨床試驗成果
延續著動物實驗的成果，諾瓦瓦克斯在2020年5月，於澳洲展開了第一、二期的人體臨床試驗。
受試者接種的疫苗分成中／高濃度抗原（每劑5／25μg），同時加入是否使用佐劑的變因，試圖推測在三期臨床試驗中，應選定的抗原濃度，以及佐劑能否人體大幅增加抗體。
澳洲的第一、二期臨床結果發現，在安全性方面，沒有嚴重或危及生命的不良反應。含佐劑之組別感到注射部位疼痛、頭痛、疲倦的比例較高；症狀通常兩天之內會減退。第2劑之產生不良反應的受試者，通常較第1劑普遍。
而在生成抗體方面，和無佐劑的組別比較，添加佐劑能讓受試者體內的抗體呈現幾何式成長。有佐劑的協助時，接種者體內的抗體可超過無佐劑受試者的100倍，強度接近曾罹患COVID-19重症康復者體內的抗體；同時也觀察到在佐劑的協助下，中、高濃度抗原所產生的抗體，其強度相似。歸總下來，諾瓦瓦克斯第一、二期臨床試驗數據顯示：
1. 佐劑能協助降低疫苗內抗原所需之用量；
2. 疫苗產生的抗體強度，和曾患重度COVID-19康復者相仿。
高度正向的研究顯示，蛋白質類型疫苗將是擊敗這場世紀大瘟疫的利器之一。
諾瓦瓦克斯於2021年3月11日發布新聞稿宣布第三期試驗的最終結果。英國約一萬五千名受試者顯示，諾瓦瓦克斯疫苗保護力約96.4%（有症狀感染），若檢視英國變異株（B.1.1.7）的保護力，也有約86.3%。此結果帶給人類極大的希望，諾瓦瓦克斯可望成為COVID-19的疫情裡，第一支蛋白質類型的疫苗。同時也鼓舞了亦屬於同類型的臺灣高端疫苗和古巴疫苗的發展。
在可期的未來裡，我們將可看到一顆顆秋行軍蟲的細胞，努力地生產著蛋白質，幫助人類挑戰流感、HIV等疾病，協助人類克服前所未有的頑疾。
保持冷靜，繼續前進。
Keep Calm and Carry On.
〔註〕病毒不被視為生物，因此並沒有「活著」或「死亡」的狀態。但為求容易理解，本文將仍帶有活性、可感染細胞的病毒視為「活病毒」。
參考文獻
1. Ian R. Tizard, Adjuvants and adjuvanticity. Vaccines for Veterinarians, 2021.
2. Cheryl Keech et al., Phase 1–2 Trial of a SARS-CoV-2 Recombinant Spike Protein Nanoparticle Vaccine, The New England Journal of Medicine, 2020.
3. Meredith Wadman, Will a small, long-shot U.S. company end up producing the best coronavirus vaccine?, Science, 2020.