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2020-11-15開發基因編輯技術CRISPR作為食品與醫藥的篩檢工具
467 期
Author 作者
陳淵銓／美國加州大學柏克萊分校生物化學博士。
近年，食品微生物帶來的食物中毒事件仍偶有發生，所以在製造、加工、儲存及運送過程中，防止食品受到病原體汙染仍應受到重視，而檢測正是確保食品安全最重要的工作。疾病的檢測如果能有準確並快速的診斷工具，對於疾病的早期鑑別和治療至關重要，從最近的2019冠狀病毒疾病（COVID-19）全球大流行亦顯示，在缺乏有效的治療藥物及預防疫苗的情況下，若無快速檢測試劑，十分不利於對疫情的控制。為維護食品安全、實施有效的疾病管制，並改善臨床醫療、照護和公共衛生措施以阻止病原體傳播及疾病惡化，CRISPR已被開發成為病原微生物的快速核酸檢測工具，深具作為居家檢測平台的潛力，且亦可開發作為藥物快速篩選的工具。
利用CRISPR位點做食品檢測
目前食品微生物快速檢測技術主要包括下列幾種方法：
1. 商業化的微量生化試劑盒；
2. 具生物親和性的抗體及DNA檢測，如免疫吸附法；
3. 側層流分析法，操作簡易且用肉眼即可觀察結果，適合用於現場檢測；
4. 免疫磁珠，可從大量的食品樣品中快速篩選出特定病原菌或毒素，節省反覆培養細菌及分離菌落的時間；
5. 免標定的石英晶體微量天平生物感測法以及生物感測器，能快速、靈敏的偵測病原體或毒素的存在。
CRISPR技術亦被運用於開發食品微生物檢測試劑，因為此技術除能快速、有效、正確地檢測食品病原菌，亦可依據細菌的基因型（genotype）作設計及調整，較傳統檢測方法更能因應病原菌之變異。研究CRISPR／Cas系統發現，不同種細菌的CRISPR位點（locus）具有高度變異性（variance）而成為基因型鑑定（genotyping）的理想根據。
CRISPR位點的差異主要呈現在以下三個方向：
1. 特定位點的間隔區的數目差異很大——主要是因為外源噬菌體及質體的入侵，據此可以估計菌株的來源及進化途徑；
2. 不同位點的CRISPR差異較大——而重複的DNA序列長度在同一菌種中保守性較高；
3. 由Cas蛋白的多態性造成的差異——雖然針對Cas酶序列操縱子的結構及組成的生物訊息分析能夠實現部分CRISPR／Cas系統的分類，但是不同菌種的基因組測序結果揭示了CRISPR／Cas的多樣性（diversity）。
利用系統發育學結合比較基因組學的方法，目前已對現有CRISPR／Cas進行分類及命名，並實現分析其差異的目的。結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis）是最早被用來作CRISPR位點分類的食品病原菌，這種被稱為「間隔寡核酸分型法（spoligotyping）」的分類方法可有效且快速檢測菌株，亦能夠有效進行棒狀桿菌（Corynebacterium diphteriae）的流行病監測及菌株系統發育分析。接著，針對不同屬菌株的分型已逐漸進行，並有若干研究結果發表，如耶爾森氏菌屬（Yersinia）、鏈球菌屬（Streptococci）、大腸桿菌屬（Escherichia）、沙門氏菌屬（Salmonella）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）等。基於以上成果可知，CRISPR位點已被廣泛應用於食品病原微生物的分子分型（molecular typing）及檢測。
醫療上也能快速篩檢疾病
CRISPR技術被引入核酸快速檢測領域，用於開發新的醫療檢測工具及試劑，為現有的檢驗及臨床診斷技術帶來突破性進展。使用傳統方法執行病毒感染診斷，如病毒分離與鑑定、病毒核酸與抗原的檢出與特異性抗體的檢測等，不僅耗時、費事且費用龐大，還需用到精密醫療設備及儀器，而且對執行檢測的醫療人員的專業水準要求也很高。因此，開發不須依賴精密器材和專業人員的新型智能性快速診斷方法勢在必行。
檢測人類乳突病毒的DETECTR平台
在2018年，美國加州大學柏克萊分校（University of California,Berkeley）道納（Jennifer Anne D o u d n a ）博士的團隊在研究中使用CRISPR-Cas12a系統切割標的的雙股D N A（d o u b l e -stranded DNA, dsDNA），發現此系統的C a s 1 2 a內核酸酶（endonuclease）活性會被活化， 而非特異性的切割單股DNA（single -stranded DNA,ssDNA），向細胞內傳遞CRISPRCas12a系統和非特異性ssDNA螢光標記的報導基因（FQ-labeled reporter gene），一旦檢測到標的dsDNA，CRISPR-Cas12a系統將啟動，同時螢光報導基因也會被降解而釋出螢光信號。
在先前發表的研究報告裡，他們已在試管中證明，用於診斷新型病毒感染的工具DETECTR（DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter）可快速準確地在病人檢體，如細胞、唾液、血液、精液、糞便、尿液以及其他分泌物中檢測出人類乳突病毒（human papillomavirus,H P V ），其中H P V 1 6 、H P V 1 8感染的檢出正確率分別是100％及92％，而HPV16和HPV18是已知會引發子宮頸癌（cervical cancer）最危險的亞種。
針對ssRNA 病毒所做的SHERLOCK試紙
在2018年，美國麻省理工學院布羅德實驗室（Broad Institute of MIT）的張鋒（Feng Zhang）團隊結合等溫前放大系統（isothermal preamplification）與Cas13內核酸酶以偵測單股RNA（ssRNA）及其工具SHERLOCK試紙，向細胞遞送多種酵素和多種不同螢光的報導基因，若CRISPR系統發現標的基因，對應的Cas13就會啟動剪切酶活性，特異性地切割相應的螢光報導基因以釋放螢光信號，可用於檢測人類檢體的茲卡病毒（Zika virus）、登革熱病毒（dengue virus）等s s R N A 病毒。在引進多種來自不同屬的細菌C a s 1 3 （ 如LwaCas13a和PsmCas13b）後，S H E R LOCK升級成為第二版的SHERLOCKv2），由於不同的Cas13對不同的RNA序列表現出不同程度的「偏愛」，與先前相比，其靈敏度提高了3.5倍。
COVID-19篩檢工具的開發
到了今（ 2 0 2 0 ）年，美國基因編輯技術疾病檢測公司長毛象（Mammoth Biosciences）與葛蘭素史克（GSK）公司宣布合作開發出一種利用CRISPR技術的新冠病毒（SARS-CoV-2）檢測平台DETECTR【筆者按：此平台與先前的DETECTR原理相同，只是檢測的標的病毒不同而已】，可快速並準確地從受測者鼻拭子RNA提取物中檢測SARS-CoV-2。研究人員使用來自美國患者的人工參考樣本和臨床樣本來驗證這個方法，臨床病例包括36個COVID-19患者和42個其他病毒呼吸道感染患者，發現檢測結果中，陽性預測一致性為95％，陰性預測一致性為100％，證明這是一種肉眼可見且快速的檢測方法，並具有潛力取代目前最廣泛使用的定量即時逆轉錄聚合酶連鎖反應分析法（quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay, qRT-PCR）。
這個檢測平台具快速、容易操作、便攜，以及僅使用一次即可拋棄的特性，能藉由簡單的鼻拭子辨認SARS-CoV-2的RNA，並不需要嚴格的實驗室環境、大型設備、精密儀器和耗時的實驗操作過程，約20分鐘內即能獲得檢測結果，而且可檢測多種傳染病，相關研究結果已發表在《自然生物科技》（Nature Biotechnology）期刊。美國FDA正在對該平台進行緊急使用授權（emergency use authorization,EUA）審查，GSK預計在2020年底前，將整個檢測平台提交給美國食品藥物管理局（U.S. Food and Drug Administration, FDA）評估，並將其推廣到醫院和診所成為即時檢測工具，再進一步提供非處方檢測，使一般民眾在家中亦可使用。
CRISPR有潛力被開發成檢測工具及試劑來快速檢測各種標的DNA或RNA，應用範圍包括檢測鑑定檢體中特定病毒（如人類乳突病毒、茲卡病毒、登革熱病毒、流感病毒及COVID-19等）、特定細菌（如大腸桿菌等）、癌症、抗生素抗藥性基因、不含細胞DNA致癌性突變及從臨床檢品中讀取人類的遺傳訊息，從而實現快速、靈敏、廉價、簡便的檢驗和臨床診斷目的，甚至能將檢測的力量帶出實驗室，直接進入民眾的家中。
潛力藥物也能透過這項技術現行
因個人體質、病情及症狀不同，選擇適用於病人治療的藥物是很複雜的，對症下藥固然眾所皆知，但在臨床上藥物的篩選並不容易。正確而快速的選擇適當的藥物，可以顯著提高醫療設備及藥物的效能，減少醫療人力及資源的浪費，藉由CRISPR技術在控制疾病標的報導基因，如螢光物質等，可望協助達成這個目標。
舉例來說，像是帕金森氏症（Parkinson’s disease）這種神經退化性疾病，真正致病原因及機轉目前仍未明。目前已知，大腦的不正常α突觸核蛋白（α-synuclein,α-SYN）累積過多是最重要的病理因子，α-SYN的SNCA基因過度表現（overexpression）是造成此種疾病發生的主因。也就是說，監控SNCA基因的轉錄可以得知帕金森氏症的病況及病理學，但使用傳統的方法測定此基因的表現，並不靈敏且耗時費事。
直到2017年，美國與韓國研究人員使用CRISPR技術在人類胚胎腎細胞株（HEK-293T cell line）SNCA基因3'端標註功能性的螢光素酶（luciferase）NanoLuc®表現者，以有效的監控SNCA基因在表觀遺傳（epigenetics）上的轉錄活性，接著於細胞培養中加入已知會調節α-SYN表現的各種不同藥物，藉由測定NanoLuc®活性即可得知α-SYN表現所受的影響程度。能抑制α-SYN表現的藥物種類相當多，利用CRISPR技術可以快速篩選適用特定病人的最有效抑制藥物。
結語
開發CRISPR作為檢測及篩選工具的研究，在國外已進行多年且成效卓著，有些產品已正式上市實際應用。而臺灣，歸納近年政府及民間支持的CRISPR醫療相關研究案，主要聚焦在疾病作用機轉、診斷及藥物開發、篩選的相關研究。以COVID-19快篩試劑為例，日前臺灣食品藥物管理署已通過首件國產抗體快速檢驗試劑，只要10∼15分鐘便能完成檢測且準確率逾90％，但因抗體須感染一段時間才會產生，在感染初期不一定能測出，故抗體檢驗試劑僅能作為輔助而不能成為診斷的唯一根據，目前仍應以核酸聚合酶連鎖反應（Polymerase chain reaction, PCR）檢驗結果為準。由此可見，開發快速核酸檢測試劑作為疾病的檢測以及篩選工具仍有必要，以現今CRISPR技術進步的速度來看，相信在不久的將來將有全面實現的可能，為疾病檢測與篩選提供全面、創新的策略，引領人類醫療進入一個嶄新的世紀。
延伸閱讀
1. Chen JS et al., CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity, Science, 2018.
2. Gootenerg JS et al., Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6, Science,2018.
3. Broughton JP et al., CRISPR-Cas12-based Detection of SARS-CoV-2, Nat Biotechnol,2020.
4. Basu S et al., A novel tool for monitoring endogenous alpha-synuclein transcription by NanoLuciferase tag insertion at the 3'end using CRISPR-Cas9 genome editing technique, Scientific Reports, 2017.