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- 612期－2020諾貝爾獎特別報導（12月號）
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2020-12-01神奇的基因剪刀手 CRISPR-Cas9
612 期
Author 作者
黃子懿／臺灣大學醫學系二年級生。陳佑宗／臺灣大學基因體暨蛋白體醫學研究所副教授。
今（2020）年諾貝爾化學獎由美國生化學家道納（Jennifer Doudna）和法國微生物學家夏彭提耶（Emmanuelle Charpentier）共享殊榮，兩人因「開發編輯基因體的方法」而獲獎。事實上，兩位致力研究的是近年相當熱門的CRISPR-Cas基因編輯系統。接下來，我們將從CRISPR的源頭開始介紹，探討道納和夏彭提耶如何發現CRISPR-Cas運用於基因編輯的可能性，並舉例說明這項研究對生物與醫學領域的影響。
回到源頭—細菌基因體中神祕的重複序列
1987年，日本科學家發現大腸桿菌（Escherichia coli）基因體中有不尋常的重複序列。這些片段的序列完全相同，具有回文性質（palindrome），且彼此間固定間隔一段特殊序列。後來，科學家發現這是原核生物基因體中常見的結構，便依其特性而命名為常間回文重複序列叢集（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR）。
之後，他們推斷這段重複序列像是細菌的免疫系統，當細菌遭噬菌體感染卻幸運存活時，便會切取一小段噬菌體的DNA，並儲存於CRISPR之間的間隔序列（spacer）。如果未來再次遭到噬菌體感染，由這些間隔序列和CRISPR重複序列所轉錄出的crRNA（CRISPR RNA），會連同一群稱為Cas的蛋白質去識別此噬菌體，並摧毀其DNA，科學家稱此破壞噬菌體基因的過程為干擾（interference，圖一）。
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圖一:鏈球菌中Class Ⅱ CRISPR/Cas機制圖
❶細菌切割噬菌體DNA（圖中彩色序列），並將其插入CRISPR重複序列（黑色）中儲存。
❷整段CRISPR DNA被轉錄為一長串crRNA。
❸ tracrRNA和crRNA重複序列配對結合，同時Cas9會和兩者形成複合體。之後，RNase Ⅲ將此長串RNA切割，產生能針對不同噬菌體的防禦武器。
❹當細菌再度被之前遇過的噬菌體感染時，crRNA可以和噬菌體DNA結合，使Cas9切斷其DNA，達到保護的作用。
在不同細菌中，CRISPR-Cas的運作模式也不盡相同，主要可以分為兩大類：Class I和Class II。兩者最大的差異在於進行干擾時，Class I需要多種Cas蛋白共同參與，有的負責鎖定目標核酸，有的則負責切割。而Class II則較為簡潔，只需要一種具有多個區域（domain）的Cas蛋白，就像是融合多種工具的瑞士刀，能執行干擾過程所需的各種功能。然而，細菌這樣的機制和基因編輯該如何產生關聯？這正是道納、夏彭提耶和她們團隊的重要突破。
道納好奇接觸CRISPR
在夏威夷長大的道納，自幼即對大自然充滿疑問與好奇，中學時，她讀了諾貝爾生理醫學獎得主華森（James Watson）的著作，激發她對生物化學的興趣。1994年，她在耶魯大學（Yale University）成立實驗室，兩年後即因確定一種RNA酶（ribozyme）的結構，而發表於《科學》（Science）期刊並獲得學界關注。之後，她到加州大學柏克萊分校（University of California, Berkeley），繼續研究RNA及RNA干擾（RNA interference, RNAi）。在那裡，她第一次接觸到CRISPR這個當時相當冷門的領域。
2006年，同在柏克萊分校的地球科學家班菲爾德（Jillian Banfield）來電，想邀請道納加入研究CRISPR的行列。完全沒聽過這個名詞的道納閱讀了當時相當有限的資料，而好奇於這特殊的干擾機制以及Cas酵素的潛在功能，於是她答應了邀約，並著手研究Class I CRISPR-Cas。2009年，她的團隊發現一種能切割DNA的Cas1蛋白，並推測這種酵素可將噬菌體DNA插入CRISPR陣列中，等同免疫記憶的形成。之後，她逐漸將重心放在Cas蛋白如何切割病毒DNA。儘管屢有突破，道納仍知道自己研究的侷限性，她希望能更瞭解較為簡潔的Class II CRISPR-Cas，而遇見夏彭提耶正好提供了新的研究機會。
夏彭提耶與化膿鏈球菌
遠在地球另一頭的夏彭提耶，成長於法國巴黎附近的小鎮，小時候即立定志向希望能對醫藥界有所貢獻。曾在1996年至美國紐約洛克斐勒大學（Rockefeller University）和微生物學家托曼能（Elaine Tuomanen）研究肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae），托曼能曾稱讚她「總
在尋求基因體中的意外發現」。2002年，她返回歐洲，在維也納大學（University of Vienna）研究化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的致病性，她也開始思考CRISPR的機制。由於她的團隊先前曾找到調節化膿鏈球菌致病因子的RNA，使她開始好奇化膿鏈球菌基因體中哪些區域會轉錄出調節RNA（regulatory RNA），以及這些區域和CRISPR是否有關聯。
在和同事佛格爾（Jörg Vogel）合作下，他們意外觀察到一種大量表現且當時未知的非編碼RNA（non-coding RNA），位置在CRISPR 陣列上游，且轉錄方向相反，他們稱之為tracrRNA（trans-activating CRISPR RNA）。進一步研究tracrRNA的序列，發現其會和crRNA配對在一起。之後，他們利用實驗證明tracrRNA和crRNA的成熟相關，且此機制涉及Class II CRISPR-Cas的Cas9蛋白（舊稱Csn1）。此研究成果於2011年刊登在《自然》（Nature），由於過去科學界並沒想過CRISPR系統可能有兩種RNA分子共同參與，因此引起熱烈討論。……【更多內容請閱讀科學月刊第612期】