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2019-11-01研究之前、人生之後-PCR、穆利斯與分子生物學 599 期

Author 作者 李依庭/本刊主編。
對於就讀生命科學系的人而言,分子生物學,是大學時期必修的課程。聚合酶連鎖反應,則為伴隨課程的實驗課大綱中不可或缺的存在,更是一個對於生科人而言不陌生、也不應該陌生的名詞。儘管這項技術的發明者——美國生物化學家穆利斯(Kary Mullis),於今(2019)年8月7日因肺炎逝世,享壽74歲。不過,他在1983年所提出的這項劃時代技術,卻成功開啟往後的分子生物學研究大門。

被分子生物耽誤的自由靈魂

在介紹這個於生物界中逐漸被人淡忘,不,應該是說,已太習以為常的一項技術原理之前,先來說說這位發明者。穆利斯,於1944年出生在美國北卡羅萊納州(State of North Carolina)的鄉村,在高中時期,便對科學產生興趣,畢業後遂前往喬治亞理工學院(Georgia Institute of Technology)就讀化學系。1972年,在加州大學柏克萊分校(University of California, Berkeley)取得生物化學學位後,並在堪薩斯大學醫學中心(University of Kansas School of Medicine)、加州大學舊金山分校(University of California, SanFrancisco)兩校進行博士後研究員,以研究蛋白質結構、合成蛋白質為主。

儘管中途曾離開科學研究領域,轉而到麵包店工作,1979年他再次回到科學界,任職於西特斯(Cetus)生物技術公司,進行著與DNA相關的研究,也是在這期間發明了聚合酶連鎖反應技術。當時,是一個分子生物學剛啟航的年代,科學家們開始了解「遺傳訊息」及「基因」的本質,並從微生物體中發現了限制酶(restriction enzyme);這種神奇的酵素可以辨認特定的DNA序列,並且可以在特定位置上進行切斷。另外,一種稱為接合酶(lygase)的酵素也被發現,可以將兩段DNA黏合在一起。科學家至此有了操作基因序列的剪刀與膠水,讓這項往後稱為基因工程(genetic engineering)的技術開始有了雛型。然而,在當時,基因工程中所使用的材料具有特定意義,或者說,是具有特定序列的DNA片段,在取得與生產上仍有一定的困難。

穆利斯在希特斯公司中原本所負責的工作其實跟上述的困難有關,簡單來說,他的工作就是接單合成寡核苷酸鏈(oligo nucleotides,即小片段、長度較短的DNA片段)。寡核苷酸鏈的合成是透過化學的方式,將核苷酸一個一個堆疊而成,步驟枯燥而繁瑣。就是這種反覆性無趣的工作,讓個性桀傲的穆利斯想著如何使用更方便的方式進行DNA片段合成。根據他自身的論述,那是一個星期五的夜晚,對於工作上寡核苷酸的合成始終不順利而一籌莫展時,當他開著車、載著女友行駛在公路上,卻忽然靈光一閃,一段段的DNA片段不斷地複製的景象從腦海中跳出來。他試想,利用特定的引子(primers)以控制溫度的方式與目標DNA片段進行專一性的結合,再透過DNA聚合酶(DNA polymerase)複製,是不是就能得到大量且所需要的DNA片段?

1953年,DNA雙股螺旋結構被發表出來;1956年,參與DNA複製的DNA聚合酶I(DN Apolymerase I)被成功分離,儘管萬事皆以俱備,唯獨只欠東風。穆利斯搜尋文獻發現,過去沒有人發表過此方法,於是,他將此想法於公司中報告,雖然一開始曾遭受質疑,認為真能如此簡單就複製出DNA?所幸,這個發想順利得到公司的支持後,便開始著手進行一連串的實驗。最終,在他和研究人員的共同研究下,分別於1985和1987年將成果發表在Science和《酶學方法》(Methods of Enzymology)期刊中。1993年,穆利斯也因為這項技術的發明,與另一位發現DNA定點突變(Site-directed mutagenesis)的生物化學家史密斯(Michael Smith)共同獲得諾貝爾化學獎。

聚合酶連鎖反應原理

故事暫且說到這裡,現在,就先來說說這項技術對往後分子生物學的影響。儘管已事隔多年,但筆者仍記得大學時期分子生物學實驗期中考的第一道題目:寫出PCR的英文全名並簡述其實驗方法和原理,儘管已不再鑽研學術、醉心研究,但這記憶仍仿如昨日般猶新。

這項技術的目的,是利用酵素對特定目標的DNA片段進行專一性複製,使小樣本在短時間內擴增,循環n次反應後,產生2n個DNA。所需材料為欲被複製的模板DNA(template DNA)、界定複製起始點兩端的引子、DNA聚合酶、合成的原料去氧核苷三磷酸(dNTP)及控制反應時所需的鎂離子(Mg2+)和穩定pH值的緩衝液。

圖一:聚合酶鏈鎖反應簡圖。在 94~96°C高溫下讓雙股模板 DNA 打開(圖示1);在約 68°C的溫度下讓引子專一地接合上 DNA(圖示2);於 72°C中讓聚合酶作用,並合成出與模板 DNA 互補的新股(圖示3);此時第一次循環完成,新做出的兩段雙股 DNA 又可當作下一個循環模板, 而每次循環都能使得擴增的 DNA 片段加倍。(by Enzoklop, CC BY-SA 3.0, Wikimedia)


誠如前面所說,它的原理其實很簡單,加入上述材料後,透過加熱模板DNA使雙股螺旋變性(denaturation),分開後開始降溫至特定溫度,讓與目標DNA互補的引子能夠專一地黏合上DNA(annealing),接著再調整溫度至DNA聚合酶工作的最適溫度,使酵素結合上的引子後端,逐步沿著模板DNA合成出一股互補DNA(elongation),此時便完成第一次循環。之後,當第一個循環完成後,所做出的兩段雙股DNA又可當作下一個循環DNA的模板,使得每次循環得到的DNA片段呈倍數增加(圖一)。......【更多內容請閱讀科學月刊第599期】