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• 20世紀，科學家發現綠螢光蛋白能讓樣本接受到激發光後，在顯微鏡下放射出綠螢光，可即時觀測生物活體內的動態變化。
• 往後，超解析度螢光顯微鏡、擴展顯微鏡技術突破了傳統光學顯微鏡的繞射極限（200 奈米），大幅提升影像解析度。
• 晶格層光顯微鏡會產生多條平行光束，在操作時能快速完成大面積樣品掃描，還有高分辨率、成像採集速率高、低光毒性等優點。

自從英國發明家虎克（Robert Hooke）於17 世紀製造出第一架光學顯微鏡，並將軟木塞切片在顯微鏡底下一格格的構造命名為「細胞」後，就此開啟了人類微生物學與細胞學的研究。19 世紀末，德國物理學家阿貝（Ernst Abbe）與亥姆霍茲（Hermann von Helmholtz）發現「繞射極限」（diffraction limit），證明光學顯微鏡解析度的極限約為波長的1/2。近幾十年來，光學顯微鏡技術愈來愈進步，成像更加清晰的光學顯微鏡逐漸追上電子顯微鏡的解析度。接下來，就讓我們一起看看顯微鏡技術的近期發展。

促進光學顯微鏡技術的綠色螢光蛋白

人類肉眼可見的光波範圍被稱為可見光（visible light），波長最短的紫光波長為400 奈米（nm），因此200 nm 是傳統光學顯微鏡（簡稱光鏡）所能分辨兩光點的最短距離。直到20 世紀初期，使用更短工作波長的電子顯微鏡（簡稱電鏡）問世，人類才得以辨識奈米等級的物體。因為電鏡與光鏡在原子與分子層次之間的解析度差異，讓電鏡無論在生物或材料結構解析上的應用都非常廣泛（圖一）。雖然電鏡大幅提升了影像解析度，但它所接收的是電子束反射或穿透樣品後的訊號，因此主要應用於形態結構的觀察。此外，電鏡還有生物分子辨識能力差、無法觀測活體、相關設備技術門檻高、造價昂貴等因素，使得電鏡的普及性受到限制，因此光鏡仍是生物學研究中不可或缺的工具。而在光鏡的應用裡，最終目標就是在三維空間解析度內達到如同電鏡的奈米解析度。

為此，科學家努力從四個面相提升光鏡的效能。第一是標定活體內的生物分子，希望觀察牠們在活體內的動態分布；第二是提升解析度，希望能看得更小、更清楚；第三是增加截取影像的速度，減少曝光時間以降低光損害〔註〕，這對活體動態研究非常重要；最後則是希望能看到完整的生物樣本影像，因此需要增加穿透度與影像的景深，期望能快速觀察整個器官、甚至是整個生物體。

註：光損害包含光毒性（phototoxicity）與光漂白（photobleaching）。光毒性是由於雷射的能量高，在照射活體細胞時可能會因自由基（free radical）的生成而對細胞產生傷害，增加了觀察到活體原始狀態的難度；光漂白則是因為雷射光的強度太強或照射時間太久，破壞了標定的螢光分子（漂白），使觀測者看不到螢光訊號。

超解析度螢光顯微鏡

20 世紀末的一項發現⸺綠色螢光蛋白（green fluorescent protein, GFP），使得光鏡技術向前邁進了一大步。日本科學家下村脩從水母中分離出GFP，並發現它具有一個特殊的發光團，能吸收藍光或紫外光後放出綠色螢光。這個有趣的實驗啟發了美國神經生物學家查爾菲（Martin Chalfie），他成功利用基因轉殖技術將GFP 基因轉殖到其他生物體。……【更多內容請閱讀科學月刊第642期】