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精準的基因編輯技術，已經革命性的改變現代生物學的發展，這些技術有些是源於自然生物機制的重新定位，如λ噬菌體的蛋白重組工程，和CRISPR-Cas9用於引發特定位點的雙鏈DNA斷裂（doublestranded DNA break）。而近期則有種較鮮為人知的機制，有了新的突破。逆轉錄子（Retron）為DNA、RNA及蛋白質的複合物，廣泛分布於細菌細胞內，可使用逆轉錄酶以產生單鏈DNA（single-stranded DNA, ssDNA）。

雖然Retron的自然功能和遺傳機制仍是個謎，但最近的研究已顯現，Retron可用於原位（in situ）進行基因體編輯。儘管如此，我們還需進一步研究以評估開發利用Retron作為精準基因編輯平台是否具有可行性。

Retron的發現與機制

長期以來，科學界原本認為逆轉錄酶（reverse transcriptase, RT）僅存在於動物病毒，但目前已發現在許多種不同的細菌有Retron此一重要元件存在。在1984年，研究人員首先在細菌DNA中的短衛星RNA／DNA分子逆轉錄物中，發現了Retron的存在，現更發現Retron存在於許多種細菌的基因組中，可以編碼逆轉錄酶並產生獨特的單鏈DNA。

利用Retron的基因編輯機制，也被稱為寡核苷酸重組工程（oligonucleotide recombineering）。不像CRISPR-Cas9利用酵素切割DNA，並啟動整合新DNA的自然修復過程；Retron的機制使用單鏈黏合蛋白（single-stranded annealing protein, SSAP）將單鏈DNA整合到正在複製的細胞基因組中，隨著細胞的分裂，子細胞會攜帶新的DNA序列。

Retron發展為基因編輯工具

目前將Retron用於基因組編輯的最新進展，是美國哈佛大學Wyss研究所及醫學院團隊的研究。團隊成員舒伯特（Max Schubert）等人根據Retron的作用原理，發展出的新基因組編輯工具RLR（Retron Library Recombineering）。此方法中，利用Retron的靶向逆轉錄活性（targeted reverse-transcription activity）產生單鏈DNA，研究團隊宣稱，此方法可用於執行超過CRISPR/Cas技術篩選規模的基因編輯，一次完成大量的基因實驗，達到特異性的高通量功能篩選（highthroughput functional screens）。研究團隊使用RLR生成多達數百萬個突變，同時將「條碼」（barcode）插入到突變細胞中，以便一次篩選整個基因池（gene pool），從而可以輕易產生和分析大量數據。

在2021年4 月29日，該研究在《美國國家科學院期刊》（PNAS）發表，文中指出，利用Retron的靶向逆轉錄活性，在細胞內產生ssDNA，最終以高於90%的效率整合編輯並實現多重應用。在研究中使用RLR對合成的抗生素抗性等位基因進行分析，證明此方法非常適合利用大量自然變異，可以做為探索基因組變異的途徑。

Retron可將突變的ssDNA引入複製中的細胞，使得該變異的DNA鏈能整合到子細胞的DNA中，而且Retron的序列可以用作「條碼」或「名稱標籤」（name tags），使科學家能在後續研究中進行追蹤，這也意味著此方法可用於基因編輯而不會破壞原來的DNA，並且可用於同時進行多個基因實驗。以大腸桿菌進行的RLR測試顯示，有90%的細菌群落會納入逆轉錄序列，而科學家則能夠通過定序Retron的條碼來找到大腸桿菌的抗生素抗性突變，從而加速探索的過程。

舒伯特認為與CRISPR-Cas9比較，RLR具有下列兩大優勢，而具有發展作為基因編輯工具的潛力：

1. 執行某些CRISPR無法做到的工作：一次傳遞大量的CRISPRCas9原料到細胞內是很困難的，而此技術可在原位隨機切碎細菌基因組，將這些遺傳片段原位轉化為ssDNA，再使用RLR同時篩選數百萬個DNA序列。

2. 操作更簡單、靈活且安全：RLR可用於高度多重化的實驗，不須使用酵素切割DNA，可排除CRISPR引發突變的可能性，並提高研究人員探索基因組突變的能力。

Retron與CRISPR的比較

CRISPR-Cas9切割DNA，將突變的DNA序列插入特定的基因組位置；Retron則將設計好的ssDNA序列嵌入正在進行複製的細胞DNA，使其進入子細胞的DNA。此外，由於Retron序列可以用作「條碼」，使得科學家能夠跟蹤個別細胞的變異情形。Retron能夠在想要編輯的細胞內產生ssDNA，而非試圖從外部引入變異的DNA序列到細胞內，並不會破壞原本的DNA序列，編輯過的基因可以持續複製且遺傳給子細胞（詳見表格）。

 

RLR用於基因編輯的限制

RLR是將選殖合成或天然的DNA變異放到質體中，再被引入細胞後，Retron再重組工程會創造可追溯的基因編輯產物，經過篩選的程序及次世代定序的分析（next generation sequencing, NGS）後，最後進行表現型的測定（phenotypic measurement）。RLR有潛力同時進行數百萬個基因實驗，並有可能成為下一個CRISPR，成為新興搶手的基因編輯技術。RLR用作基因編輯工具看似頗有前景，其限制如下：

1 . Retron只可作為供給者（donor）：Retron本身是尚未研究得很清楚的細菌逆轉錄元件，進行靶向逆轉錄時會產生單鏈DNA。目前研究已經顯示，此處的ssDNA可在基因組中創建特定編輯時作為重組工程的供給者，這意味著Retron與CRISPR並不相同，僅可以作為「供給者」。然而，CRISPR通常可以同時扮演「供給者」及「引導者（guide）」的角色。

2. Retron目前僅於細胞培養的實驗中成功：Retron已成功用於細菌細胞的基因標靶作用（gene targeting），或者在酵母菌、人類細胞培養中與 CRISPR結合以提高編輯的效率，但迄無成功用於植物細胞、田間試驗或動物實驗的文獻或報告。

3. 編輯的效率及成功率仍有待進一步研究、測試及改善。

結論

RLP可成功將所需DNA變異序列整合到標的基因組中，隨著細菌複製，含有變異DNA序列的細菌數目及比例會隨著時間的推移而增加；而CRISPR的「一次性」（one shot）方法往往在第一次試驗時便可決定成功或失敗，這是RLR與CRISPR二者編輯系統的一大區別。如果要將RLR用作新式基因編輯工具，現階段最有可能的方式應該是Retron與CRISPR合併使用，作為輔助方法，以提高編輯性能及效率，或者可以在許多CRISPR不適合的研究中，如引發突變或細胞毒性作為替代方案。