- 科技報導
文章專區
2020-10-15CRISPR運用於人體醫療的潛力及挑戰
466 期
Author 作者
陳淵銓／美國加州大學柏克萊分校生物化學博士。
以CRISPR技術發展最精密及敏感的領域，應屬涉及人體醫療的部分。人體治療要求的技術層次最高，考量的關鍵議題最多，各國法規要求及限制亦最嚴格。CRISPR可精準地執行基因編輯，且有正確修復基因突變並應用於疾病臨床治療的潛力，而成為精準醫療（precision medicine）的基石，因此，目前世界主要先進國家，均投入大量人力與資金發展CRISPR醫療領域的應用。
人體醫療的應用
遺傳性疾病
遺傳性疾病主要是由於先天性基因突變而導致，傳統治療方法僅能控制病情而無法根治，因此，基因治療便成為治癒遺傳性疾病的唯一選擇。
基因治療產品目前主要仍在研發或臨床試驗階段，但也有已核准上市者，如用於治療家族性脂蛋白脂質分解酶缺乏症（familial lipoprotein lipase deficiency, LPLD）的格利貝拉（Glybera），是歐洲藥物管理局（European Medicine Agency,EMA）核准的第一個基因治療產品；美國食品藥物管理局（U.S. Food and Drug Administration, FDA）則分別已核准兩種使用嵌合抗原接受體T細胞（chimeric antigen receptor T cells, CART）療法的基因治療產品，包括用於治療25歲以下的復發性和難治性B細胞急性淋巴性白血病（acute lymphoblastic leukemia）患者的金利亞（Kymriah），和特定型大B細胞淋巴瘤（large B-cell lymphoma）成人患者的葉斯加塔（Yescarta）。其他疾病如鐮刀型貧血症（sickle cell anemia）、β－地中海型貧血症（β-thalassemia）、肌肉營養不良症（ m u s c u l a r dystrophy）、α1－抗胰蛋白酶缺乏症（α1- antitrypsin deficiency）、萊伯氏先天性視網膜萎縮症（Leber congenital amaurosis）和囊腫性纖維化（cystic fibrosis）等的基因治療產品，也仍在開發中。
CRISPR技術雖可顯著加快基因治療產品的發展，但仍應密切注意潛在之風險。P53基因是人體內重要的修補基因，是最早發現的腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene）之一，p53蛋白能調節細胞週期和避免細胞癌變發生，保持基因組的穩定性，避免突變發生。在2018年，《自然醫學》（Nature Medicine）同時刊登了兩篇文章，研究人員發現CRISPR／Cas9會誘發p53蛋白大量表現。瑞典卡羅林斯卡研究所（Karolinska Institutet）研究人員以人類視網膜上皮（retinal pigmented epithelial-1, RPE-1）細胞來進行研究，發現由Cas9蛋白所引發的雙股斷裂（double-stranded break, DSB）將會誘發p53蛋白的活化及表現，而p53蛋白的活化將使細胞生長停滯，並啟動DNA的修補機制。但當p53蛋白的活化被抑制後，由Cas9蛋白所啟動的基因編輯成功率則大幅提高，意味著P53抑癌基因若異常或突變，CRISPR技術引導的基因編輯成功率將會增加，而這正可解釋為何CRISPR的基因編輯成功率在腫瘤細胞中較高，因為許多腫瘤細胞的P53基因都有發生突變的情況；另一方面，美國諾華生物醫學研究所（Novartis Institutes for BioMedical Research）研究人員也在人類多功能幹細胞（human pluripotent stem cells, hPSC）發現了類似的狀況，使用Cas9穩定的整合或進行暫時性的Cas9－核酸蛋白（ribonucleoprotein, RNP）傳遞，發現嵌入或刪去（insertion or deletion, indel）的效率較以往高出80％，這意味著Cas9蛋白引發的DSB會殺死hPSC，而有毒反應發生是因為P53基因的功能受到強烈的抑制。這兩則研究的結果顯示，抑制P53基因的表現，可以改善未轉變細胞的基因編輯效率，但是在使用CRISPR進行治療時需監控p53蛋白的功能。
藉由CRISPR進行人體治療時，為確保治療成功率須同時抑制p53蛋白的活化，可能會相對增加罹癌的風險，所以，若要應用CRISPR於遺傳性疾病的臨床治療，必須進行更多安全性研究。
病毒感染疾病
近年，美國研究人員利用CRISPR設計的單股引導核醣核酸（single guide RNA, sgRNA）標靶作用於鼻咽癌病毒（Epstein-Barr virus,EBV）負責結構、轉變和潛伏性感染（latent infection）所需的基因，發現在細胞培養中的病毒承載量（viral load）大幅降低。而使用CRISPR設計的sgRNA，標靶作用於單純疱疹病毒第一型（herpessimplex virus-1, HSV-1）蛋白質的表現和複製所需的ICP0基因，在細胞培養的研究結果也顯示，病毒的生長大幅降低。此外，美國研究人員也於2017年使用CRISPR治療人類後天免疫缺乏症候群（acquired immunodeficiency syndrome, AIDS），成功的剔除人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）。
臺灣研究人員則是於2014年利用CRISPR設計的sgRNA標靶作用於B型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）的基因組上，發現在細胞和小鼠實驗中HBV核蛋白（core protein）和表面蛋白（coat protein）的表現顯著減少，顯示此技術有潛力用於根除HBV的潛伏性感染。
神經退化性疾病
大腦的α-SYN蛋白在引發帕金森氏症（Parkinson’s disease）上扮演關鍵的角色，此種蛋白大量製造且無法分解是造成病變的主因，故調節或干擾SNCA基因（構成α-SYN蛋白）的表現，將有助治療帕金森氏症。2017年，美國研究人員開發一名為PRISM的基因功能篩檢平台，利用隨意的CRISPR／Cas 轉錄因子（crisprTF）廣泛地干擾轉錄網絡，在一系列帕金森氏症模式中，鑑定出可調節轉錄網絡和保護細胞免於α-SYN蛋白毒性的導引核糖核酸（gRNA）。透過調節能力差異的測試，篩選出保護性最強的gRNA，並在人類的帕金森氏症模式中進一步確認其對抗αT-SYN蛋白引發細胞死亡的能力，而crisprTF的運用則可顯現複雜的生物外表型和有效的疾病調節作用。
另外一個將CRISPR用於神經退化性疾病的例子，便是阿茲海默症（Alzheimer’s disease）。大腦的澱粉樣蛋白（amyloid precursor protein, APP）基因的瑞典型突變（Swedish mutation）引起澱粉樣蛋白-β（Aβ）的β－分泌酶（β-secretase）切割，（cleavage）被認為是引起遺傳性阿茲海默症的原因。在 2018 年，美國研究人員設計的sgRNA及Cas9藉由腺相關病毒（adeno-associated virus, AAV）作為載體，標靶作用於APPSW等位基因（allele），發現在細胞培養和動物實驗中可以選擇性的破壞這些基因，修復因Aβ增加而引起的點突變（point mutation）而降低病理性的Aβ。
癌症
像是肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的發生，被認為與SIRT6蛋白過度表現有關，而微核醣核酸－（125bmiR-125b）已知可降低SIRT6蛋白過度表現而抑制肝癌，肝癌患者的miR-125b表現通常比較低，而SIRT6蛋白表現則較高。在2018年，中國研究人員使用CRISPR技術設計的sgRNA標靶作用於SIRT6基因，發現在細胞培養中可以增強miR-125b的表現而抑制肝癌細胞。
細胞週期蛋白依賴性激酶（cyclindependent kinases, CDK）的過度表現被認為與乳癌的發生有關， 使得CDK抑制劑具有治療乳癌的可能性。在2018年，英國研究人員使用失活的CRISPR技術（deactivated CRISPR／Cas9 approach, dCRISPR）作用於CDK-18基因，強化內源性CDK18啟動子（endogenous CDK18 promoter），發現在細胞培養中會使得CDK-18蛋白大量表現而使乳癌細胞顯著增加，意味著標靶作用於CDK-18基因具有抗乳癌的可能性。
可能的挑戰及解決之道
專一性不足
CRISPR作用於標的基因時會產生脫靶效應，造成不可預期的變異，雖然現在的技術已可大幅降低發生的比率，但完全避免是不可能的。脫靶效應在細胞及動物實驗時，只要妥善處理此種變異細胞或動物即可，但用在臨床試驗及人體治療時，萬一引起突變或甚至致癌，後果難以補救。因此，改善CRISPR作用於DNA的專一性極為重要，解決之道包括改善CRISPR試劑的DNA專一性、改善基因組編輯試劑的專一性，以及利用蛋白質工程和蛋白質傳遞改善鹼基對編輯的專一性和應用性等。
安全性顧慮
胞嘧啶（cytosine）自發性脫胺作用的C-G鹼基對轉變成T-A，已知會造成人體內的致病性點突變，故有效地將A-T鹼基對直接轉變為G-C而無須切割DNA，將有助於遺傳性疾病的治療。在2017年，美國研究人員開發腺嘌呤鹼基編輯器（adenine base editor, ABE）控制A-T鹼基對轉變成G-C，轉運核糖核酸（transfer RNA, tRNA）的腺苷脫胺酶（adenosine deaminase）在與受損的CRISPR／Cas9突變種融合時會作用在DNA。其中，第7代ABE已能有效的將A-T鹼基對轉變成G-C，在人類細胞效率約有50％，作用產物純度高達99.9％，而序列的插入與刪除比率則在0.1％，ABE較現行的Cas9內核酸酶方法在造成點突變時，更有效且脫靶效應更低。目前科學家已發現，人類細胞培養在不產生DSB的情況下，ABE可直接而有計畫地引發所有4種核苷酸的置換（transition）突變，如此，在使用CRISPR技術治療疾病時，便無須抑制p53蛋白的活化，即可獲得很高的效率，亦提高了在人體內使用的安全性。
作用侷限性
CRISPR在基因組編輯的最重要限制，是在標的位置須有最小化間隔相鄰基序（protospacer adjacent motif, PAM）存在，使得作用具有很大的侷限性，傳統上來自產膿鏈球菌（Streptococcus pyrogene）的Cas9（SpCas9）所需的PAM是NGG。在2018年，美國研究人員發現一種經過改造的Cas9變異種，在哺乳動物細胞中所需的PAM不限於NGG，他們利用噬菌體開發了擴展型的PAM SpCas9變異種（xCas9），可辨認較廣的PAM序列，包含NG、GAA和GAT。儘管xCas9辨認範圍較廣，但專一性卻較SpCas9高而具有較低的脫靶效應，這個發現不但擴大了CRISPR的DNA標靶作用範圍，且無須權衡Cas9編輯效率、PAM可獲得性（compatibility）及作用於DNA專一性，僅須在其中選擇一個，提供三者得而兼顧的可能性。
結論
CRISPR技術在人體治療上相當有潛力，但大多僅止於基礎研究階段，進入臨床試驗或產品真正上市者很少，主要仍有不少挑戰仍待克服，但近來在研究人員不斷努力開發新技術及新試劑下，對這些問題已提出一系列解決之道。因此，CRISPR可望在不久的將來應用於人體臨床治療，將人類的醫療科技帶到一個全新的境地。
延伸閱讀
1. Komor AC, Badran AH, Liu DR, CRISPRbased technologies for the manipulation of eukaryotic genomes, Cell, 2017.
2. Chen YC et al., Randomized CRISPR-Cas transcriptional perturbation screening reveals protective genes against alpha-synuclein toxicity, Mol Cell., 2017.
3. Haapaniemi E. et al., CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response, Nat Med., 2018.
4. Ihry RJ et al., p53 inhibits CRISPR-Cas9 engineering in human pluripotent stem cells,Nat Med.,2018.