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2020-04-01藥來救命—對抗冠狀病毒的藥物開發策略 604 期

Author 作者侯明宏／中興大學基因體暨生物資訊學研究所教授兼所長。饒行佑／中興大學基因體暨生物資訊學研究所博士後研究員。林珊夢／中興大學基因體暨生物資訊學研究所博士後研究員。

冠狀病毒（coronavirus）是一種在動物與人類之間傳播的人畜共通RNA病毒，在電子顯微鏡下呈現球狀或橢圓形狀，因外觀具有囊狀膠原纖維突出，形似皇冠狀，因而稱為冠狀病毒。目前已知可以感染人類的冠狀病毒有7種，分別為HCoV-229E和HCoV-OC43、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、嚴重急性呼吸道症候群（SARS-CoV）、中東呼吸道症候群（MERS-CoV）及2019冠狀病毒疾病（SARS-CoV-2）。

根據國際病毒學分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV），冠狀病毒分為四個屬：α、β、γ和δ。HCoV-229E和HCoV-NL6屬於α－冠狀病毒；HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV及HCoV-OC43是β－冠狀病毒，它們都僅感染哺乳動物。γ－冠狀病毒和δ－冠狀病毒感染鳥類，但其中一些也可以感染哺乳動物。

冠狀病毒的結構及蛋白種類

冠狀病毒的基因組大小在26000~32000個鹼基對，是基因組規模最大的一類RNA病毒。病毒內的RNA基因組在感染週期的RNA合成中起重要作用，在5’端的基因序列編碼的主要是轉譯（translation）多蛋白Pp1ab，能被病毒蛋白酶作用分解成16 種非結構蛋白並參與基因的轉錄（transcription）及複製（replication）。3’末端的基因序列編碼主要是轉譯冠狀病毒的四種結構蛋白，包括核鞘蛋白（nucleocapsid phosphoprotein,N）、棘蛋白（spike glycoprotein,S）、醣膜蛋白（membrane glycoprotein,M）、外套膜蛋白（envelope small membrane protein,E），這些蛋白構成冠狀病毒的結構。此外，這些蛋白不僅協助病毒體的組裝，也可以抑制宿主的免疫反應促進病毒複製。

冠狀病毒的生命週期

冠狀病毒的複製開始於病毒表面的棘蛋白與宿主細胞表面受體分子上結合後，脫掉外殼將RNA基因組釋放到細胞質中。而基因組也因為有5’端帽（five-prime cap）的甲基化（methylation）和3’多聚腺苷酸尾（poly-A tail），使它能附著在人類核糖體上進行轉譯，並合成新的病毒。目前所有人類冠狀病毒與人體結合的受體都已被鑑定出來，包括HCoV-229E的胺肽酶N（aminopeptidase N）；HCoVOC43和HCoV-HKU1的唾液酸（9-O-acetylated sialic acid）；SARS-CoV、HCoV-NL63及SARS-CoV-2的血管收縮素轉化酶II（angiotensin-converting enzyme II,ACE2）和MERS-CoV的二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase 4, DPP4）。

除此之外，某些冠狀病毒也可以藉由蛋白酶的幫助進入細胞，例如組織蛋白酶L（cathepsin L）可以協助SARSCoV和MERS-CoV進入細胞中，跨膜蛋白酶絲胺酸2（transmembrane protease serine 2,TMPRSS2）和呼吸道胰蛋白酶TMPRSS11D（airway trypsin-like protease TMPRSS11D）則可以活化棘蛋白，協助HCoV-229E 和SARS-CoV進入細胞膜。

抗冠狀病毒的藥物開發策略

2003年，由於SARS-CoV的爆發造成嚴重的疫情後，抗冠狀病毒藥物的開發逐漸受到重視，而開發策略可被歸納成主要的三種模式：

第一種策略為測試具廣效性抗病毒活性的臨床藥物，以抑制新型病毒活性。使用此策略進行藥物開發的實例包括干擾素α（IFN-α）、干擾素β（IFN-β）、干擾素γ（IFN-γ）及利巴韋林（ribavirin）。這類藥物的明顯優勢在於容易獲得，並具有已知的藥物動力學、藥效學特性、副作用及劑量使用數據。缺點則是不具特異性的抗病毒效應，可能會導致較嚴重的副作用。

第二種策略為針對化合物資料庫進行快速且高通量篩選，優勢在於可獲得許多現有的化合物，馬上進行抗病毒測定，但缺點為在體外試驗（In vitro）中表現出抗病毒活性的藥物，可能在臨床階段無明顯抗病毒活性。透過此策略進行開發出的藥物有HIV 蛋白酶抑制劑「洛匹那韋－利托那韋（lopinavir-ritonavir）」，在非人類靈長類動物模型和非隨機臨床試驗中顯示出抑制病毒的效果。

第三種策略涉及新型試劑的創新開發，包括針對特定病毒蛋白設計的siRNA分子、特定病毒酵素開發的抑制劑、標靶（target）宿主受體的單株抗體（monoclonal antibody）及標靶宿主細胞中參與在病毒複製週期的蛋白酶抑制劑。雖然此開發策略取得的藥物大多可在體外與體內抗病毒試驗中皆顯示出活性，但由於藥物動力學和藥效學等性質皆須重新試驗，所以開發這些前導藥物成為臨床用藥通常需要耗費更多時間。

抗冠狀病毒藥物開發現況

雖然冠狀病毒具高度的物種多樣性，但是不同冠狀病毒間有許多相似的組成元素，適合作為藥物開發標靶。目前針對冠狀病毒的藥物開發，可分為以病毒為開發對象或以宿主為開發對象的兩種治療方法。

以抑制病毒為開發的治療方法

1. 標靶病毒遺傳分子：
標靶核苷（nucleosides）或核苷酸（nucleotides）的抑制劑通常具有廣效抑制活性，可對抗多種冠狀病毒及其它病毒。其中，黴酚酸（mycophenolic acid, MPA）可抑制嘌呤（purine）合成途徑中的關鍵酵素——肌苷酸脫氫酶（inosine monophosphate dehydrogenase, IMPDH）。此分子在許多體外試驗中顯示出具抗多種病毒的活性，包括乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus, HCV）和節肢動物攜帶性病毒（arboviruses）。近期，通過高通量篩選策略，黴酚酸被鑑定為一具潛力的抗MERS-CoV藥物，且在體外試驗中呈現強烈的抗MERS-CoV活性，然而目前於動物試驗中並未具治療效果。

2. 標靶病毒酵素：
病毒蛋白酶（proteases），可以水解生成成熟的複製酶（replicases），在病毒複製中扮演重要的角色。因此，標靶病毒蛋白酶為開發抗病毒藥物的一種方法。病毒蛋白酶抑制劑可阻斷冠狀病毒的複製，藉此抑制病毒感染。其中，木瓜蛋白酶（papain-like protease, PLpro）和3C蛋白酶（3C-like protease, 3CLpro）是生成複製酶多蛋白pp1a和pp1b過程中重要的兩種蛋白酶。

近期研究顯示，某些1,2,3－三唑（1,2,3-triazole）的衍生物可在低劑量下發揮抑制冠狀病毒CoV-229E的活性，並於隨後的分子模擬實驗中說明這些化合物可能藉由作用於CoV-229E的3C蛋白酶，進而影響其複製。

此外，在冠狀病毒複製週期中，解旋酶也扮演不可或缺的角色，能催化雙鏈寡核苷酸（duplex oligonucleotides）鏈解成單鏈，所以解旋酶抑制劑也是一項治療選擇。目前可大致分為兩類，第一類包括果聚醣（bananins）和5－羥色酮（5-hydroxychromone）衍生物，可透過抑制SARSCoV解旋酶活性，從而抑制病毒複製。另一類為三唑化合物，如SSYA10-001可抑制多種病毒，包括SARS-CoV、MERS-CoV和小鼠肝炎病毒（mouse hepatitis virus）。然而，這些化合物所產生的毒性限制在臨床上的應用。

3. 標靶病毒棘蛋白：
病毒表面棘蛋白是病毒與宿主細胞受體相互作用時的重要蛋白，在結構上，棘蛋白包含負責結合細胞受體與負責膜融合的兩個結構域。其中，結構裂解是活化膜融合（syncytium formation）與病毒進入細胞的關鍵步驟。所以，標靶棘蛋白結構域與裂解的藥劑，均具有強大的抗冠狀病毒活性。目前以棘蛋白為標靶開發的抗病毒試劑主要包括單株抗體、抗病毒肽及碳水化合物結合劑。其中，針對SARS-CoV棘蛋白不同結構域所設計的單株抗體在體外試驗及動物模型中皆表現出抗病毒活性，而針對MERSCoV棘蛋白開發的單株抗體在小鼠試驗中顯示出保護作用，但藥物對人體的治療效果仍應進一步評估。

除了單株抗體以外，標靶棘蛋白不同結構域的抗病毒肽可藉由破壞病毒正常結構達到抗病毒效果，在小鼠實驗中顯示對感染MERS-CoV的小鼠具保護作用。而另一個成功的抗病毒肽為恩夫韋地（enfuvirtide），標靶HIV-1棘蛋白已上市並用於治療受人類免疫缺陷病毒HIV-1型感染的病人。碳水化合物結合劑為另一類針對棘蛋白開發的藥物，其中包括蛋白質格里菲斯辛（griffithsin），可鍵結到病毒棘蛋白，藉此抑制病毒侵入宿主細胞。目前，此分子在體外試驗中能抑制多種冠狀病毒的活性，包括SARS-CoV、HCoV-229E、HCoV-OC43及HCoV-NL63；也在小鼠試驗中顯示能抑制SARS-CoV的感染。不過，在人體試驗上的治療效果仍需進一步評估。

4. 標靶病毒其他蛋白：
病毒核鞘蛋白、醣膜蛋白、外套膜蛋白及一些輔助蛋白在病毒體組裝是不可或缺的，也可能具有抑制宿主免疫反應以促進病毒複製的功能。在體外試驗的研究中，發現標靶SARS-CoV核鞘蛋白、醣膜蛋白及外套膜蛋白的SiRNA能抑制病毒複製的能力。另外，也有許多透過結構生物學（structural biology）開發的化合物，包括六亞甲基阿米洛利（hexamethylene amiloride），作用於SARS-CoV與HCoV-229E的外套膜蛋白，並藉抑制此蛋白離子通道的活性達到抑制病毒的效果。此外，化合物PJ34作用於HCoV-OC43的核鞘蛋白，藉由干擾此蛋白與病毒遺傳物質結合的能力達到抑制效果。

近期，研究人員透過核鞘蛋白的N端保守區域，建立一套新穎且具潛力的抗冠狀病毒藥物開發策略。此策略利用小分子穩定核鞘蛋白N端保守區域上的非典型交互作用（non-native interaction），藉此造成核鞘蛋白間不正常聚集，使喪失保護病毒遺傳物質的功能。以此策略開發出之化合物5-benzyloxygramine，於體外試驗中顯示出抗MERS-CoV 活性。

以治療宿主為主的治療方法

宿主的干擾素反應（interferon response）可抑制感染後病毒複製的能力。干擾素的反應可以通過給予重組干擾素或干擾素誘導劑而增強。在體外試驗和動物模式實驗中，重組干擾素和具抑制SARS-CoV和MERS-CoV複製的能力。此外，兩者與其他抗病毒藥劑搭配使用的方式目前已用於治療受SARS-CoV或MERS-CoV感染的患者。而干擾素誘導劑如聚肌胞苷酸（poly I:C），在小鼠試驗中能抑制MERS-CoV的活性；另一種干擾素誘導劑硝唑尼特（nitazoxanide），對RNA 和DNA病毒均具有抗病毒活性，目前於治療HCV和流感的人體試驗中，已分別進入II期和III期臨床試驗。

以其他宿主元素為開發目標

冠狀病毒利用特定的宿主元素（host factors）進入宿主細胞並複製，這些宿主元素也被作為開發抗病毒試劑的標靶，如前面所述的ACE2和DPP4等。在不誘導宿主免疫病理作用下，標靶宿主受體的試劑就是潛在的抗冠狀病毒試劑。目前標靶宿主受體的抗病毒試劑包括DPP4單株抗體，在體外試驗中顯示能抑制MERS-CoV進入細胞的活性。此外，ACE2抑制劑在體外試驗中顯示具抗SARSCoV活性。

另一方面，如前所述，冠狀病毒也可以藉由蛋白酶的幫助下進入細胞，因此，宿主蛋白酶抑制劑可藉由阻斷病毒進入細胞，達抑制效用。例如甲磺酸卡莫司他（camostat mesylate）為TMPRSS2的抑制劑，在體外實驗中發現可抑制SARS-CoV 和MERS-CoV 活性，並可提高SARSCoV感染小鼠的存活率。此外，而弗林（furin）抑制劑在體外試驗中顯示出可抑制MERSCoV進入細胞途徑。然而，此類藥劑皆尚未在受冠狀病毒感染的患者中測試其活性。

COVID-19 的解藥？

無庸置疑，冠狀病毒已經被列入本世紀人類致病源（human pathogens）的重要排行榜，特別是在過去短短20年中已經爆發三次冠狀病毒大流行。SARS、 MERS和COVID-19的出現，使得找出重要的藥物標靶及發展出有效抑制冠狀病毒的先導藥物成為當務之急。

近期，隨著COVID-19的疫情逐漸擴大，全世界無不致力於在尋找及開發治療的藥物。由美國吉利德科學公司（Gilead Science）研發的新藥瑞德西韋（Remdesivir）及日本富山化工製藥公司開發的法匹拉韋（Favipiravir）被認為是有望用於治療的藥物。

瑞德西韋為核苷酸類似物的前驅藥物，過去研究證實可以透過抑制依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRP）的活性，藉此影響SARS-CoV和MERS-CoV的複製。在動物實驗中也證實瑞德西韋可以改善受感染SARS病毒小鼠肺部病理狀況。研究指出，SARSCoV-2與SARS-CoV 的胺基酸序列相似度高達90％，因此被認為潛力的治療藥物。

而法匹拉韋則是一種吡嗪羧酰胺（pyrazinecarboxamide）的衍生物，同樣具有抑制RdRP活性的功能。然而，在臨床試驗當中尚未有結果，針對COVID-19的治療策略也尚未確立。

目前在臺灣，國家衛生研究院及中央研究院相繼宣布成功合成瑞德西韋，與此同時，財團法人生物技術開發中心也宣布成功合成法匹拉韋。不過，現階段臨床上還是缺乏明確能針對冠狀病毒的專門治療方法，仍需要科學家繼續找尋新的抗病毒策略與標的來對抗冠狀病毒的感染。