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2020-02-01與「鼠疫」的防治角力 不為人所知的上古疾病與預防策略
458 期
Author 作者
陳淵銓／美國加州大學柏克萊分校生物化學博士。
什麼是鼠疫？它是如何發生的？
鼠疫是一種人畜共通（zoonotic）的傳染性疾病，是由革蘭氏陰性鼠疫桿菌（Yersinia pestis）感染所引起，最先反應處是媒介昆蟲（insect vector，通常是跳蚤）咬傷的部位；症狀通常在接觸後1~7天開始發作，初期徵候包括發燒、頭痛、寒顫、不適、虛弱及白血球增多。鼠疫桿菌的生命週期始於媒介昆蟲，然後傳播至哺乳動物宿主，通常是囓齒類動物（如家鼠、野鼠及土撥鼠等），再藉由與媒介昆蟲的直接接觸傳播給人類，或經由飛沫在人與人間傳播。
而由鼠疫桿菌所引發的人類疾病，根據主要的臨床症狀又可分成腺鼠疫（bubonic plague）、肺鼠疫（pneumonic plague）及敗血性鼠疫（septicemic plague）三類（表一）。受到鼠疫桿菌感染的哺乳動物通常會表現出明顯症狀，如果不及時治療，則可能會導致繼發淋巴腺發炎、肺炎及敗血病。直接吸入霧化的鼠疫桿菌會導致極度致命性的原發性肺炎，潛伏期短的肺鼠疫死亡率尤其高。
鼠疫流行簡史
這樣的疾病已影響人類數千年，在歷史上曾有三起大流行。
鼠疫首次發生於6世紀，起源於埃及的西奈半島（Sinai Peninsula），後波及到歐洲所有國家，死亡近2500萬人。第二次發生於14世紀，起源於中東的美索不達米亞（Mesopotamia），僅在歐洲就造成約2500~5000萬人死亡，估計當時共導致超過7500萬人死亡，為最嚴重的一次，有世紀黑死病（black death）之稱。第三次則是在19世紀末至20世紀初的東亞及印度，造成約1200萬人死亡。
進入2 1 世紀後雖不曾發生鼠疫的大流行，但根據世界衛生組織（World Health Organization, WHO）統計，2010~2015年期間，全世界每年仍有約600個鼠疫病例發生，例如2015年美國有4人因鼠疫死亡；2017年，馬達加斯加島經歷鼠疫大暴發，總共有2348個確診病例，其中202人死亡；而去（2019）年，蒙古及中國亦有零星案例發生。
由於公共衛生的改善，鼠疫在已開發國家已被認為是上古疾病，但不可否認，鼠疫在全球廣大地區仍零星存在，對低開發國家及貧困人口的影響仍不可忽視。雖說鼠疫的活躍程度不及其它較為人所知的傳染病，如愛滋病、瘧疾、流行性感冒、結核病、登革熱及抗藥性細菌所引起的疾病，但它畢竟曾是最嚴重公共衛生問題之一，歷史上的大流行亦曾改寫了人類的文明發展，因此大家對這個疾病的關注程度不應降級，對未來鼠疫可能爆發的持續擔憂更是不可免除。如今，研究人員發現可能已有具抗生素抗性（antibiotic resistance）的鼠疫桿菌出現，使得鼠疫在國際上也被認為是正在重新出現的疾病。
深具威脅性並有潛力發展為生物武器
美國政府於1999年根據引發疾病的威脅性，將病原體分成A、B及C級三類；其中，A級危害程度較大，B及C級的危害程度較輕，而鼠疫桿菌正被歸類為六種須優先應變處理的A級病原體之一（表二）：
基於鼠疫的高傳染性、高致命性及無有效預防疫苗等特性，鼠疫桿菌被認為具潛在的生物威脅性，且有被恐怖主義份子用作生物武器的可能性。在上世紀美蘇冷戰期間，美國疾病管制與預防中心（Centers for Disease Control and Prevention, CDC）曾研發可霧化的鼠疫桿菌作為生物武器，直到冷戰結束後才成為禁忌。雖說國際間對生物武器的研發管制甚嚴，但世界各國祕密研究的事實仍時有耳聞。
鼠疫疫苗的研發
雖然拜現代醫藥發達之賜，目前已有多種可有效治療鼠疫的抗生素出現，如慶大黴素（gentamicin）、去氧羥四環素（doxycycline）、氯黴素（chloramphenicol）、胺基糖苷類抗生素（aminoglycosides）、四環黴素（tetracycline）及慶大黴素和氟喹諾酮類（fluoroquinolone）的結合等， 而美國食品藥物監督管理局（U.S. Food and DrugAdministration, FDA）最近又批准了左氧氟沙星（levofloxacin）。
然而，對於暴露於鼠疫（特別是肺鼠疫）威脅的高危險族群而言，仍有接種疫苗的需要。目前已研發出多種鼠疫候選疫苗，但市場上仍無已獲許可的產品（licensed product），基於接種疫苗是長期保護的有效策略，持續開發一種安全、有效的疫苗是有必要的。在這裡，筆者將探討近（2018~2019）年間鼠疫疫苗開發的最新進展，評估可能的預防疫苗。
奈米疫苗－長期免疫成為可能
首先要給讀者一個前情提要。鼠疫桿菌的F1抗原（含蛋白次單位的高分子量聚合物）會在夾膜（capsule）產生過程中被送到細菌表面，V抗原（LcrV蛋白）則是由第三型分泌系統（type III secretion system）分泌的毒性因子（virulence factor），兩者均可促進體液免疫作用（humoral immunity）和細胞介導免疫作用（cell-mediated immunity），被認為是引發抗鼠疫免疫力的主要抗原。脂質體是一種脂質雙層（lipid biolayer）的奈米粒子（nanoparticle），具備雙極性（amphiphilicity）、生物相容性（biocompatibility）、生物降解性（biodegradability）、低毒性、特異性、捕獲親水性／親脂性藥物的能力及易於進行表面修飾等特性，可作為將藥物的活性分子傳遞至作用部位的載體（carrier）。
因此，美國科學家設計了一種由「負載F1抗原和V抗原的聚酸酐奈米粒子（F1-V antigen-loaded polyanhydride nanoparticles）」和「環狀二核苷酸佐劑（cyclic dinucleotide adjuvant）」結合的奈米疫苗（nanovaccine），並對接種這種疫苗的小鼠血清進行分析。
分析結果發現，接種疫苗後的血清產生與多種F1和V線性表位抗原（linear epitope）結合的血清抗體，且血清抗體對F1和V的線性表位抗原表現出高度親和力，可同時啟動F1抗原與V抗原兩種免疫反應。另外也發現，小鼠骨髓中存在維持高含量的「抗原特異性血清免疫球蛋白IgG」和有助於更多的B細胞熟成以產生更大量抗體的「F1-V抗原特異性漿細胞（plasma cell）」。這些結果顯示，F1-V抗原的聚酸酐奈米顆粒和環狀二核苷酸結合的奈米疫苗能快速誘導長期免疫反應，是很有前景的下一代鼠疫疫苗。
疫苗對鼠疫的保護作用也相當重要
另外，美國研究人員也設計一款含鋁膠（Alhydrogel）及重組F1和V（rF1-V）抗原的鼠疫疫苗，是為候選次單位疫苗（candidate subunit vaccine），可產生由強烈T輔助細胞2（T helper cell-2, Th2）控制的體液免疫作用和由適度T輔助細胞1（T helper cell-1, Th1）控制的細胞介導免疫作用。
若要針對鼠疫桿菌產生保護性的抗體，則需要Th2體液免疫作用和Th1細胞介導免疫作用，因此他們重新設計rF1-V次單位疫苗，使它包含強大的免疫檢查點分子「SA-4-1BBL佐劑」和有效的Th1誘導劑（inducer）以提高效力（efficacy）。評估rF1-V次單位疫苗對肺鼠疫的保護效果後，發現用SA-4-1BBL重新配製的次單位疫苗誘發了很強的Th2體液反應及Th1細胞介導反應；雖然同時產生了高水平（high level）的兩種免疫反應，但用佐劑重新配製的rF1-V次單位疫苗的初級－加強免疫（prime-boost immunization）導致鼠疫候選次單位疫苗失去對肺鼠疫的保護作用。儘管出乎研究人員意料，但這些發現證明，產生保護作用所需的免疫機制十分複雜，這將有助於開發出更好的預防肺鼠疫的次單位疫苗。
臺灣開發－可用微針貼片遞送的疫苗
雖說臺灣已很久沒被捲入鼠疫的戰爭，但防患未然的心總是要有的。因此，臺灣研究人員使用引發抗鼠疫免疫力的主要抗原──鼠疫桿菌F1蛋白作為模型抗原，建立高效抗體誘導技術平台。他們使用專利配方，製備了有F1抗原負載的脂質體（F1-liposome），並以磷酸食鹽水緩衝液（phosphate buffer saline, PBS）作為溶劑，使用Biuret蛋白質濃度分析法（bicinchoninic acid assay）分別對該脂質體進行體外與含量測定。最後， 他們利用已商業化生產的微針貼片（microneedle patch）作為傳遞工具，將製備的F1抗原負載的脂質體（F1-liposome）經由皮膚接種疫苗（skin vaccination）於具有免疫勝任能力（immunocompetent）的小鼠，使其產生免疫反應（圖一）。
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圖一：F1 抗原負載的脂質體的製備及利用微針貼片進行皮膚免疫接種。
實驗期間，研究人員每隔7天定期抽取這些免疫小鼠的血液（共45天），使用酵素連接的免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）評估抗F1抗原免疫抗體IgG的效價（anti-F1 IgG titer）。此外，為確認免疫反應，在接種後35天測定細胞激素（cytokine）的含量，如白介素－4（interleukin-4, IL-4）、干擾素－γ（interferon-γ,IFN - γ ） 及腫瘤壞死因子－ α（tumor necrosis factor, TNF-α）。
比較實驗組（F1-liposome）與對照組（PBS和F1-Alugel）在動物實驗的結果，包括F1 IgG抗體效價測定（antibody titer assay）、細胞激素反應測試（cytokine response tes t）和動物挑戰測試（an imal challenge test），用以評估小鼠的免疫反應及受鼠疫桿菌感染後的存活率。結果發現，F1-liposome讓小鼠表現出最強的免疫力，顯示用微針貼片作為遞送工具開發有效的F1抗原負載脂質體鼠疫疫苗相當可行。
國際組織對疫苗產品的期待
WHO在2018年國際鼠疫疫苗研討會上規劃了目標產品的輪廓（target product profile, TPP）的範疇，此範疇中至少有17種鼠疫疫苗候選產品正在研發，包括次單位疫苗（如包含F1抗原和／或V抗原及佐劑）、利用細菌載體（如沙門氏桿菌）的疫苗、利用病毒載體（如Ad5、Chad病毒）的疫苗、利用大腸桿菌T4噬菌體的疫苗及表達一種或多種鼠疫桿菌主要抗原（如F1抗原、LcrV抗原、YscF抗原和／或鼠疫素凝固酶）的活性減毒（live attenuated）疫苗，並已在不同的動物模式中進行了測試。其中，已有兩個已經完成了第二期臨床試驗，還有幾個在去年已進入臨床試驗。
而該範疇對於鼠疫疫苗的要求和考慮因素包括：可誘發持久免疫力、對生活在流行地區／參與鼠疫發生調查或監視的衛生工作者可進行管理等。對於治療性疫苗的要求和考慮因素則包括：在接種第一劑疫苗後可迅速產生保護性免疫力、保護鼠疫發生區域的個體以阻斷傳播鏈。最近許多研究結果顯示，疫苗的效力與設計方式及接種途徑有很大關聯性，而異源初級－加強免疫（heterologous prime-boost immunization）可能比同源初級－加強免疫（homologous prime-boost immunizations）〔註一〕更具免疫誘導性。因此，不同疫苗形式的組合，如包含次單位、活性減毒及利用活載體的結合型鼠疫疫苗可克服目前的限制，並有效地預防鼠疫的發生。
合格鼠疫疫苗尚未問世 仍須謹慎應對
雖然臺灣自1953年起即未發生過鼠疫的病例，但因鼠疫在世界上許多國家仍有零星病例發生，所以大家還是要提高警覺。眾所皆知，疾病的預防重於治療，由於迄今無合格鼠疫疫苗產品上市，故防治策略首重病媒防治，如杜絕齧齒類動物的食物來源和堵塞其藏匿處、保持周圍環境清潔避免堆積雜物、定期檢查居家內外以防止齧齒類動物繁殖等。人員防護方面建議穿著長袖衣物及長褲，必要時在外露的皮膚及衣服上塗抹含避蚊胺（diethyltoluamide）成分的驅蟲劑。外出旅遊則應避免到疫區停留，如要到訪鼠疫的流行地區，應遠離老鼠出沒的地區，切勿接觸活的或死的齧齒類動物，並防止被跳蚤叮咬。
〔註一〕「異源初級－加強免疫」指的是使用兩種不同的物質，即同時投予可表現專一性抗原的載體（vector）及抗原蛋白誘發相對應抗體產生，用以強化初始的免疫效力（efficacy）和保護時效（duration），這種載體和抗原的組合可同時增加抗體和T 細胞的免疫誘導性（immunogenicity）；「同源初級－加強免疫」則是使用一種物質，即只投予可表現專一性抗原的載體或抗原蛋白其中之一來誘發相對應抗體的產生，用以強化初始的免疫效力和保護時效。
延伸閱讀
1. Wagner DA et al., Single-dose combination nanovaccine induces both rapid and longlived protection against pneumonic plague, Acta Biomater, 2019.
2. Bowen W et al., Robust Th1 cellular and humoral responses generated by the Yersinia pestis rF1-V subunit vaccine formulated to contain an agonist of the CD137 pathway do not translate into increased protection against pneumonic plague, Vaccine, 2019.
3. Chen YC et al., Development of Yersinia pestis F1 Antigen-loaded liposome vaccine against plague using microneedles as a delivery system, Journal of Drug Delivery Science and Technology, 2019.
4. Sun W and Singh AK, Plague vaccine: recent progress and prospects, NPJ Vaccines, 2019.