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2019-10-16基因編輯技術CRISPR在精神疾病及神經退化性疾病的應用
454 期
Author 作者
陳淵銓／美國加州大學柏克萊分校生物化學博士。
基礎研究及治療
精神疾病及神經退化性疾病的
在所謂的精神疾病、精神障礙（mental disorder）或心理疾病中，患者會在行為、心理及活動等方面表現出紊亂的精神症狀，病因包括外在因素（如家庭、社會環境等）及內在因素（如生理、遺傳、神經生化等）。而神經退化性疾病（neurodegenerative disease）則屬「沉默的流行病（silent epidemic disease）」，目前僅知與遺傳基因及年紀老化有密切關係，但也可能與其它風險因子有關。以上兩者的真正病因及作用機轉，目前仍未十分清楚且尚無有效的治療方法（表一）。
現存相關藥物大多只能短暫控制發病時間及症狀，且預後狀況普遍不佳，而新藥的開發進展也相當有限。隨著全球老年人口的逐漸增加及社會環境的變遷，此兩種病例日益增加，對家屬、患者和社會造成莫大衝擊，研究人員及各大藥廠均致力於開發出更有效的治療方法。
其中，基因編輯技術──叢集間隔短回文重複序列（clustered regularly interspaced short palind romicrepeat, CRISPR），已被應用於這兩種疾病的基礎研究及潛在治療，如酒精或藥物成癮（addiction）、思覺失調症（schizophrenia）、阿茲海默症（Alzheimer’s disease）、帕金森氏症（Parkinson’s disease）及亨丁頓舞蹈症（Huntington’s disease）等。以下將帶讀者深入了解基因編輯探究疾病治療的方法。
CRISPR∕Cas9作為基礎研究的工具
動物模式的重要性
為了測試各項藥物或療法的效用，許多研究都會用到動物模式（animal model）：某種動物自發或經人為誘導而產生特定疾病或生理反應，若與人體有類似生命現象，則應可用該種動物作為「模式」，以了解人類罹患此疾病或發生該生理反應的機制。然而，人類疾病具多樣性，並非所有動物都可產生與人類相似的疾病，如何選擇最適當的動物及使用何種方法建立動物模式，便成為一種專門的學問。
表二為一般動物模式分類，包括誘發或實驗模式（induced or experimental model）、自發或自然模式（spontaneous or natural model）、負或無反應模式（negative or non-reactive model）及孤兒模式（orphan model）等四種。其中，最常見的為誘發或實驗模式，主要透過基因轉殖（genetic cloning）、基因敲入（knock-in）及基因剔除（knock-out）等方法來完成。
動物模式的建立
說到實驗動物，讀者應該聽過小鼠（mouse）與大鼠（rat）這兩種動物。
大鼠的身體和大腦尺寸較大，便於進行實驗時藥物的管理、多次採樣、活體內電生理學（electrophysiology）的研究及神經手術、神經成像的程序等，且大鼠具有更精細和準確的運動協調機制，也能展現更複雜的社交行為。此外，大鼠與人類一樣含有6種微管相關蛋白（microtubule-associated protein）──濤蛋白（tau）的同種型（isoform），並與人類脫輔基脂蛋白質E（apolipoprotein E, ApoE）的胺基酸序列間存在很高的同源性（homology）。
由於在生理、形態和遺傳上的特性更接近人類，傳統上認為大鼠是研究精神疾病及神經退化性疾病較理想的模型。然而，與基因轉殖小鼠（transgenic mouse）相較之下，基因轉殖大鼠的發展因技術問題而較緩慢，直到CRISPR技術開發成功後，藉由準確而快速的修飾、活化及抑制特定基因，才徹底改變大鼠的基因編輯效率，而基因編輯也不再侷限於小鼠。
動物模式成功建立的例子
由於CRISPR與其它編輯基因技術相比，具有簡單、迅速、準確及低成本的優勢，故現已成為最熱門的技術。很多疾病的研究原本沒有適當的實驗動物可供採用，在CRISPR技術的幫助下，科學家可以更精準、方便及快速的開發動物模式，而且有些已經商業化生產，以下幾個都是近年發生、相當不錯的案例。
酵母菌模式的建立
除了動物模式外，酵母菌也能拿來檢核細胞的部分功能。
大腦的不正常α-突觸核蛋白大量製造卻無法分解，是已知引發帕金森氏症的主因，故調節或干擾α-突觸核蛋白（alphasynuclein, α-SYN）基因（SNCA）的表現有助於治療此病。使用CRISPR技術的轉錄網絡（transcriptional network）廣泛性基因組干擾作用，可進行系統性及標的性的SNCA基因調節。
美國研究人員已於前（2017）年開發PRISM（perturbing regulatory interactions by synthetic modulators），使用隨意的CRISPR/Cas轉錄因子（crisprTF）作為篩選平台以廣泛干擾轉錄網絡，運用PRISM到酵母菌（Saccharomy cescerevisiae）的帕金森氏症模式中，鑑定出可調節轉錄網絡和保護細胞免於α-突觸核蛋白毒性的單股引導RNA（single guide RNA, sgRNA），藉由調節能力差異的測試，篩選出最強的保護性sgRNA，並在人類的帕金森氏症模式中進一步確認其對抗α-突觸核蛋白引發細胞死亡的能力，透過隨意的crisprTF，可以顯現複雜的生物外表型和有效的疾病調節作用。
基於CRISPR的潛在治療
目前已有許多直接利用CRISPR技術來治療精神疾病及神經退化性疾病的文獻，明顯加速了這些疾病的研究進程，許多相關研究正在進行細胞實驗，有些甚至已在動物實驗中成功，經由移植幹細胞或直接修飾相關基因可以提供新的治療策略，並有相當潛力於臨床應用。像是古柯鹼（cocaine）成癮（addiction）這種強迫性尋求藥物（drug-seeking）的腦部疾病，一旦服用藥物過量而成癮，即使經過長時間戒除，也很容易復發。今年，美國研究人員使用CRISPR技術分別對小鼠及人類的皮膚表皮幹細胞（skin epidermal stem cell）進行基因改造，敲入丁酰膽鹼酯酶（butyrylcholinesterase）基因後，再移植回小鼠體內，結果顯示移植的皮膚細胞可以表現出較高活性的丁酰膽鹼酯酶以分解古柯鹼，並保持該酵素的長期釋放，以保護小鼠免於古柯鹼的藥物尋求行為及使用過量，由此可知，經由促進藥物分解的皮膚細胞移植來進行細胞治療（cell therapy），或許可以提供另一種治療藥物成癮的選擇。
另外，γ-胺基丁酸（gamma-aminobutyric acid, GABA）的A型接受體（GABRA2）變異，可能導致精神疾病、癲癇、酒精中毒和藥物濫用，如今似乎也有解決方案。美國研究人員今年使用CRISPR修復實驗小鼠GABRA2基因的缺失，完全恢復了小鼠腦中GABRA2基因表現的mRNA和蛋白質的含量，且發現該小鼠可以作為研究神經生物學和行為分子遺傳學的背景種株（background strain），並進一步顯示GABRA2基因療法（gene therapy）治療藥物濫用或精神疾病是有可能的。
而引發阿茲海默症的可能原因──大腦的瑞典型類澱粉前驅蛋白（the Swedish
Mutation of amyloid precursor protein, APPsw）基因突變，引起β-釋放激素（β-secretase）切割類澱粉前驅蛋白，進而產生類澱粉蛋白-β（amyloid-β, Aβ）並在大腦大量堆積，其與死亡受體6（death receptor6, DR6）結合後所啟動的細胞凋亡（apoptosis）過程，應能受惠於CRISPR的發現。去年，美國研究人員設計單股導引RNA（sgRNA）及Cas9蛋白，藉由AAV作為載體讓標靶作用於APPSW等位基因，發現在細胞培養和動物實驗中可以選擇性的破壞APPSW等位基因，可降低病理性類澱粉蛋白-β含量。因此，使用CRISPR技術可以修復造成類澱粉蛋白-β增加的點突變（point mutation），並有潛力發展成為對抗阿茲海默症的基因療法。
以基因編輯技術做藥物篩選
不只是療法本身，在藥物的篩選與各項功能的優化上，也是CRISPR可以幫上忙的地方。舉例來說，已知大腦的α-突觸核蛋白的過度表達是造成帕金森氏症的關鍵病理因子，監控SNCA基因的轉錄應可得知其病況及病理學，但使用傳統方法測定此基因的表達並不靈敏且耗時費事。前年，美國及韓國的研究人員便利用CRISPR技術在人類胚胎腎細胞株（HEK-293Tcellline）SNCA基因3'端標註功能性的NanoLuc螢光素酶報告者（luciferase reporter），以有效監控SNCA基因在表徵遺傳（epigenetics）上的轉錄活性，接著在細胞培養中加入已知會調節α-突觸核蛋白表現的各種藥物，藉由測定NanoLuc活性表現差異來得知α-突觸核蛋白表現所受的影響程度。目前可用於抑制α-突觸核蛋白表現的藥物種類相當多，利用CRISPR技術可以快速篩選適用特定病人的最安全、有效的藥物，有助帕金森氏症精準醫療的發展。
前景與挑戰
儘管使用CRISPR技術治療精神疾病及神經退化性疾病深具前景，但仍存在不少技術限制、安全性問題和倫理議題的挑戰，需審慎評估；幸運的是，拜現代科技突飛猛進之賜，目前已開發許多因應策略來改善不良影響並克服大多數的挑戰，如表三所示。
結論
CRISPR技術可用於產生基因轉殖大鼠，此種實驗動物具有超過小鼠的優勢，用以研究精神疾病及神經退化性疾病，並有助於開發更多新穎的治療策略，包括細胞療法和基因療法等。因此，我們應盡可能關注基因編輯技術的發展，探討其對以往藥物難以治療疾病的重要性，研究人員還應加強並擴大未來的研究方向，並開發這些新發現成果的可能應用。