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- 576期－諾貝爾獎特別報導（12月號）
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2017-12-012017 諾貝爾生醫獎——晝夜節律
576 期
Author 作者
陳示國／國立臺灣大學生命科學系副教授。實驗室主要利用分子生物學之方式，研究小鼠感光細胞如何調控生理時鐘代謝等生理功能。
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傑佛瑞·霍爾（Jeffrey C. Hall, 1945~）
國籍：美國
現任：布蘭戴斯大學生物學榮譽教授
研究領域：遺傳學、週期基因 |
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麥可·羅斯巴希（Michael Rosbash, 1944~）
國籍：美國
現任：布蘭戴斯大學生物學教授
霍華德‧休斯醫學研究所研究
研究領域：遺傳學、時間生物學 |
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麥可·楊恩（Michael W. Young, 1949~）
國籍：美國
現任：洛克菲勒大學教授與副校長
研究領域：時間生物學、生物學 |
為什麼大部分人早上起床總是艱辛困難？為什麼出國工作或是旅遊還要面對讓人全身上下哪裡都不對勁的時差？又為什麼許多急性心臟疾病好發於傍晚？
時間，是一個對人類非常有趣而又難以捉摸的概念。許多歷史文明都在早期發展出記錄時間流逝的方法。 然而，直到近60~70年內我們才慢慢發現，幾乎每 一個生活在地球的物種，原來在體內都有一個調控一切生理功能的時鐘。在午夜時期，我們的體溫會降至最低，然而凌晨太陽出來前，就算還沒有起床，身體就會先慢慢開始加溫，預備起床後需要較高的體溫進行活動。在太陽下山後數小時，體內的松果體開始釋放褪黑激素，幫助我們身體準備入睡。在晚上的時間，體內的血液幹細胞數量為最大數，並在我們休息時製造出最多的血球，而在此之前的下午時分，血液幹細胞就準備從骨髓中被釋放出來。由此可知，生理時鐘能讓各個生物在一天中不同時間，預先準備相對應的生理功能，用最有效率的方式應付一天下來日夜溫差等環境劇烈的變化。
生物體內的生理週期
在歷史文獻中，很早就有記載動植物每一天會有一些規律的生理現象。在西元前400 年，亞歷山大大帝的將軍安德羅斯提尼（Androsthenes of Thasos）與艦隊航行時，在日誌中記載了酸豆樹（羅望子）的葉片會在白天展開，在晚上關閉。而中醫中的《子午流注》（由黃帝內經整理而成）也記載了人體氣血的運行隨著一日中的時間而變化，原文一開始即寫到「子午流注者，謂剛柔相配，陰陽相合，氣血循環，時穴開闔也」。 然而，這些記載並沒有明確指出這些現象是因為外在環境所調控或是生物體內有內生性節律，直到過了千年後，在18世紀，才有一位天文學家麥蘭（Jean Jacques d'Ortous de Mairan），利用實驗方式，來探討生物時鐘的問題。他發現含羞草在白天時葉子會打開朝向太陽，而在晚上會合起。為了證明此現象是由外在日夜週期所誘導或是體內真的有一個生理時鐘，他將含羞草放在暗盒中，發現就算沒有環境日夜週期，在暗盒中含羞草依舊保持每日週而復始的葉片開合循環，證實在生物中有個生理時鐘在控制一天中相對應的生理週期。
在1900年代，許多科學家投入生理週期的研究，奠定了這個學門的基礎知識以及定義。晝夜節律 （circadian rhythm）這個英文單字，是由希臘文中 circa（大約）以dian（天）所組成，原始的意思是接近24 小時的週期性生理現象。而晝夜節律這個單字，也準確的點出生理時鐘所代表的生理意義。我們體內的生物時鐘，並不是準確的以每日24小時作為一個循環，大部分的日行性動物，在沒有接受外界日夜訊息時，以每一個週期稍微大於24小時進行循環，而大部分夜行性動物則以小於24 小時為一天作為循環。科學家定義當沒有任何環境因子存在時，依舊能保持接近24 小時的週期性生 理現象才能稱作晝夜節律，而這樣的情況稱之為自主生理時鐘（free running）。
平均而言，人類的週期一天大約是24.3小時，因此，若沒有任何環境訊息，我們每天會越來越晚睡，也越來越晚起床，所以早上爬不起床、晚上睡不著，是體內生理時鐘作祟的其中一個因子。除了自主生理時鐘之外，晝夜節律第二個重要的定義在於環境同步（entrainment），也就是生理時鐘可以被外在環境訊息所微調並且與其同步。一般而言，日夜週期是調整生理時鐘最強而有力的環境因子。我們的生理時鐘，在一天中的不同時段，會對於外界的光線有不同的反應，例如在傍晚，光照會讓我們的生理時鐘延後，而清晨光照則會使我們的生理時鐘往前調整。結合這些光照，我們身體內的生理時鐘，才能由每天24.3 小時左右的自主生理時鐘，每天微調成24 小時，與地球自轉一周的24 小時日夜週期同步。也因此，出國調整生理時鐘最好的方式就是要在對的時候照光，前幾年甚至有科學家為此寫了一個行動應用程式（app）告訴你在何時照光來加速時差的調整呢！最後一個特點是生理時鐘有著溫度自我調整的能力，一般生化反應會隨著溫度的增加而加速，然而，生理時鐘對於溫度有良好的調整回饋，不論環境溫度的升高或下降，生物在冬天或夏天生理時鐘每一個週期走的速度不會相差太多。要不然，當冬天平均氣溫比夏天下降10%，我們的生理時鐘速度也慢了一半的話，那每日週期就要變成雙日週期了。
生理週期的發現
雖然這些生理時鐘的特點逐一被歸納研究，然而體內為何有內生性的規律週期依舊讓科學家們疑惑。如果生理時鐘由某些細胞內的分子機制所控制，那麼，在某些具有特定突變的個體中，生理時鐘的週期應該會有所不同。而研究這類問題最佳的模式物種，就是奠定近代遺傳學實驗的模式生物——果蠅（Drosophila melanogaster）。1970 年代對生理時鐘這個研究領域而言非常重要，首先在1970 初期，本澤（Seymour Benzer）以及他的學生科諾普卡（Ronald Konopka）發現了生理時鐘特別快、特別慢以及失去日夜節律的3 種果蠅突變個體［註一］，他們把這個未知的突變基因命名為period，即週期的意思。而在相同的時期，摩爾（Robert Moore）以及朱克（Irving Zucker）2 個研究團隊也在哺乳動物中發現視交叉上核（Suprachiasmatic nucleus, SCN），就是負責生理時鐘的腦部核區。當果蠅period 突變株出現後，許多研究團隊相繼努力的想要將此基因找出，然而一直要到了1980 年代，才由今（2017）年諾貝爾生理學或醫學獎得主中的3 位科學家，也就是霍爾（Jeffrey Hall）、羅斯巴希（Michael Rosbash）以及楊恩（Michael Young）將period 基因找到。
1980 年代是基因克隆（clone）技術成熟的年代，那個時候大家都競爭著要將不同的基因定序，霍爾曾經是本澤的博士後研究員，當他到布蘭代斯大學（Brandeis University）後，就跟他的同事羅斯巴希合作；楊恩則在耶魯大學（Yale University）進行許多不同基因的定序。兩團隊同時在1984 年發表論文表示他們成功定序了period 基因。後來，兩團隊的的研究成果都指出本澤當初發現的這三隻生理時鐘有問題的果蠅，都是因為period 基因出現突變，只不過突變的位置不同，而造成完全不同的結果。很可惜的是，本澤已在2007 年過世，要不然今年諾貝爾獎委員應該會為怎麼把獎平分給4 個人而頭大〔註二〕。當然，利用基因突變來尋找生理時鐘基因並不是果蠅研究者的專利，在之後的20多年間，科學家陸續在小鼠、倉鼠、阿拉伯芥、麵
包黴菌（Neurospora）以及藻類等模式生物中，找到了控制生理時鐘的基因。後來，因為基因以及蛋
白質序列的分析，科學家發現大部份與生理時鐘相關的蛋白質，均有一段類似的序列稱為PAS 區段，而且每個物種雖然隨著演化的過程，變得各自不同，但是大家在控制生理時鐘上，都還是利用相似的系統，日日夜夜計算時間的流逝。
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分子生物學家和行為遺傳學家本澤。（Wikipedia）
生理時鐘系統的運作
所以生理時鐘的系統是如何運作的呢？經過霍爾以及羅斯巴希2 位科學家的合作，以及羅斯巴希實驗室中一位博士後研究員哈定（Paul Hardin）的研究，發現由period 基因轉譯出來的蛋白質PER在一天中均有表現，但是其表現量（包含mRNA和蛋白質）會在夜晚時變高，而在白天時降至最低。然而，在PER 蛋白質無法作用的果蠅突變株中，也就是之前研究所發現沒有生理週期的那一個突變株，period 基因反而高度表現。因此，他們大膽的提出生理時鐘是由一個負回饋（negative feedback）迴路所調控，period 基因表現後所產生的PER 蛋白質，可以回頭抑制本身基因的表現量。之後，楊恩找到另一個生理時鐘的基因——timeless，timeless 基因製造出來的TIM 蛋白質與PER 蛋白質相互結合，進入細胞核後，對period基因和timeless 基因產生抑制作用。當然，僅有一個負回饋路徑是無法形成週而復始的日夜循環的，楊恩又再發現另一個基因——doubletime，這個基因製造出來的蛋白質DBT 負責為PER 蛋白質進行磷酸化（Phosphorylation），當PER 蛋白質被些微的磷酸化後，就會被分解掉，直到TIM 的蛋白質累積足夠量之後，PER 才能夠免於被分解，並且與TIM 一起進入細胞核。這樣一個基因表現以及蛋白質數量累績出現的延遲，是生理時鐘中，調控週期長短非常重要的因素。試想，若一個可以抑制自己本身產出的物質，在沒有任何時間延遲的狀況下，這個物質是沒有辦法被生產出來的。因此，DBT 負責控制PER 蛋白質的數量，延緩PER 蛋白質累積，使其累積速度大約比period 基因的表現晚了4~6 小時。如此，一個週期性的負回饋路徑才能一日又一日規律的反覆下去。除了「調控基因表現」的負回饋調控之外，「蛋白質調控」在生理時鐘的運作也扮演非常重要的角色。
近年來，更多調控生理時鐘的基因陸陸續續被找到，除了period 這類負回饋因子之外，還有許多正因子分子生物學家和行為遺傳學家本澤。（Wikipedia） 參與生理時鐘的運轉，這些正因子，包含果蠅中的clock 和cycle，以及哺乳動物的clock 和Bmal。以果蠅為例，每日的下午，CLOCK 與CYCLE 蛋白結合啟動period 與timeless 的基因表現，到了傍晚 PER 蛋白質才開始慢慢累積，因為DBT 會磷酸化 PER 造成其降解。到了午夜，PER 終於累積到足夠的數量，與TIM 一起進入細胞核中，抑制自己的基因表現。一直到了清晨，period 與timeless 基因表現下降至最低，因此，白天的時候PER 蛋白質在細胞質內的數量也因降解而下降，這時，CLOCK 與 CYCLE 蛋白終於解除了被抑制的狀況，在下午的時候再度結合啟動period 與timeless 的基因表現。這樣的分子機制，就是由3 位得獎者的研究所奠下基礎而逐漸發展出來的（圖一）。到了現在，我們已經知道超過10 種以上控制生理時鐘的基因，並且組成了像魔術表演一樣，環環相扣的狀態，一個個串在一起，提供一個非常穩定的時鐘。
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④ 下降到細胞質內PER 與TIM 表現量極少時，此時週期又進到下午。這時，CLOCK 與CYCLE 終於解除了被PER 與TIM 抑制的狀況，於是再度開啟period 與timeless 基因的表現（回到①）。
① CLOCK 與CYCLE 蛋白在下午時活化，啟動period 與timeless的基因表現，由於DBT的作用，PER至傍晚（4~6小時）待TIM 越來越多後，才逐漸累積（延遲效應）。
② 到了午夜，PER 足夠後，與TIM 一起進入細胞核中，負回饋抑制CLOCK 與CYCLE 蛋白對於period 和timeless基因的啟動，抑制 PER 與TIM 蛋白的生成。
③ 清晨，period 與timeless 基因表現量降至最低。白天的時候PER 蛋白因period 基因被抑制沒有新的蛋白質生成，而現存的蛋白質降解，因此在細胞內整體數量下降。
圖一：生理時鐘的分子機制示意圖。
人類的生理時鐘
雖然生理時鐘最主要的是幫助生物預測24 小時間環境的劇烈變化，以及在一日活動週期中不同時間、最佳化不同的生理功能，那我們自然會關心生理時鐘與人類的健康是否有關連。因此，關於生理時鐘在人類上也有不少的研究，我們知道人類睡眠與清醒週期是被生理時鐘所調控，可能很多人都有經驗，晚上熬夜大約在凌晨3~4 點的時候最想睡，但是過了這個時間，睡意似乎會消失一點，且身體的反應也會變得比較快，這是因為生理時鐘調控睡眠的力道在凌晨後會慢慢變弱。
而近年來，也有許多研究指出，生理時鐘混亂或許對健康真的有些影響，包含代謝疾病、心血管疾病、心理疾病以及癌症。在工業現代化的年代，許多工作需要夜間值班，這類工作時間不定的人比起一般白天上班的人，有更高的機率得到過胖以及糖尿病等代謝疾病，也有較高的機率出現心血管疾病。另外，航空業在長途飛行的航線上，機組人員長年來需要在不同時區間工作，統計分析指出這些人得到癌症的機率也較一般大眾稍微高一些。不過，這比一些遺傳因子所造成的影響，還是小得多，因此，大家不需要太恐慌而不敢出國、到不同時區的地方旅遊。如果從另一個面向來看，癌症研究指出，癌症病人的癌細胞中，除了致癌基因外，也曾發現生理時鐘的基因出現混亂的現象。甚至有些人類基因學的研究指出，許多生理時鐘基因的變異，與心理疾病有關聯性。綜合這些觀點，有一個良好並且與環境同步的作息，讓體內的生理時鐘幫助我們，規律性的調節並且整合生理機能，可以讓我們維持最佳的健康狀態。
結語
最後，我們也要感謝這三位諾貝爾獎得主科學家的努力，讓我們了解生理時鐘在體內基因層面如何運作，這些成果，開啟了更多近代對於生理時鐘的研究，晝夜節律這個研究領域，相較其他生物學領域，算是較晚起步，因此還有許多未知的問題等待我們去探索，而且當前研究也還大部份著眼在生理時鐘的基礎。或許我們可以期許未來，當我們對生理時鐘有更全面性的理解後，可以讓大家在不同的環境下都有良好的健康，或是對於調整時差有更好更快速的方法。最後，祝福大家都有個健康的生理時鐘，好似《莊子．讓王》所云：「日出而作，日入而息，逍遙於天地之間」。
〔 註一〕：三隻突變果蠅，依據其生理時鐘週期的快慢，特別快的命名為perS，特別慢的命名為perL 以及失去日夜節律的命名為per0。
〔 註二〕：截至目前為止，諾貝爾獎單一獎項最多分給三個得獎者。