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2018-02-01探究箭毒蛙「死道友，不死貧道」的生物毒物特性
578 期
Author 作者
嚴宏洋／國立海洋生物博物館特聘講座教授。
南美洲哥倫比亞西北邊山區的喬科省（Chocó）原住民長久以來一直將「分趾蟾科（Dendrobatidae）」中的「毒葉蛙屬（Phyllobates）」蛙（土著將它稱之為kokoi 蛙）的 皮膚分泌液（也是稱之為kokoi）塗抹在箭頭上，用來麻醉被射中的獵物。早在1869年有位哥倫比亞的研究者阿朗戈（Posada Arango）首次以論文報導這毒物的生物特性。1957年時瓦斯森（S. H. Wassen）對如何製作此箭毒及其藥理特性給了簡單的描述。
箭毒蛙的毒液
但對這種蛙毒進行系統性的研究，要等到1960年代起才開始，由美國的研究人員馬吉（M. Märki）及威特科普 （B. Witkop）對黑腿箭毒蛙（Phyllabates bicolor）毒液的生化特性及對神經的毒性，做科學化的研究。kokoi 蛙體重約有1公克、體長約2~3 公分而已。一般是藏身於地表的植被內很難被看到，但土著們會在吹口哨時，同時用手指頭敲擊臉頰，而發出fiu-fiu-fiu 的聲音。kokoi 蛙就會發出相同的回應叫聲，土著們就可以藉此定位去抓這蛙。因為經驗的關係，土著們在抓這蛙時都要用樹葉包著手，避免直接碰到蛙的皮膚，然後將牠們裝在竹筒內帶會部落。處理時用竹子製做成的竹籤（名稱siuru kida），從蛙嘴穿過身體，放在火上烤，會使得乳白色毒液從背上的皮膚釋出。土著們就將箭頭沾上這毒液，然後晾乾。一隻毒蛙所分泌的毒液，可以製備約50隻箭頭。箭頭後方會裝上棉花狀的填充物，使其能與吹箭筒可以密合。而吹箭筒主要是用「芎榙棕櫚（chonta palm）」葉脈而製作成的中空吹筒，長度約為20~25公分。
過去在部落間的戰爭時，毒箭頭曾被用來射殺敵人；但目前只用來獵取豹、鹿、猴子及鳥類時使用。獵物在中箭後會導致癱瘓，然後死亡。獵人會用刀割下中箭部位周邊的肌肉及箭頭，以避免事後誤食。事實上這種毒素，與來自植物的「箭毒（curare）」一樣，是不會經由口腔進入體內。 但若口腔黏膜有傷口，就會導致中毒。
1962年8月時馬吉及威特科普團隊的拉薩姆（M. Latham） 女士在「杉莞流域（Rio San Juan）」地區採集了330隻 kokoi 蛙，然後每十隻一組用乙醚麻醉安樂死後，將皮膚取下切成小片，在室溫下用甲醇粹取約2~3小時。然後倒掉上層溶液，再添加新的溶液，經過一夜後再過濾，進行真空乾燥，再冷藏於冷凍庫內。以白老鼠為材料，確認了這蛙毒的50%致死濃度（LD50）為 570（±40）μg/kg。 這些初步的研究工作，以今天的標準來說是簡陋了些，但是對後續的研究工作，奠定了基礎的知識。
蛙毒有毒化合物研究
接著在美國國家衛生研究院工作的達利（J. W. Daly）在 1964、1966年也加入蛙毒的研究。當時在鄰國巴拿馬從事兩棲、爬蟲類研究的邁爾斯（C. W. Myers）向達利提出，共同合作有計畫的對分佈於「杉莞流域」地區所有的毒蛙皮膚分泌的有毒化合物，進行整合性的研究。當時他們想要測試的一大假說是：若箭毒蛙的體色越是鮮艷，牠的皮膚分泌物的毒性，也會相對的高，以達到「警戒色」的目的。
但結果卻令他們很失望，因為所得到的數據無法支持他們的假說。但是這些大規模長達30 多年的持續研究，發現到毒蛙所分泌的毒素，包括蟾毒素（batrachotoxin, BTX）以及一些雙環的生物鹼，如高毒性的普密力托辛（pumilitotoxins）、三環類（coccinelline-like tricyclics）、表巴蒂啶（epibatidine）、愛濟啶（izidines）、吡咯啶（pyrrolidines）和幾乎無毒的十氫喹啉（decahydroquinolines）。達利與邁爾斯多年的工作和其它研究者們的努力，一共分離出超過800 種生物鹼和至少20 多種新的化學結構。更獨特的是這些天然化合物，只存在於毒蛙的分泌物。毒蛙的毒液所含的生物鹼，到底是透過什麼生理機制而導致動物的死亡呢？後續的研究發現這些生物鹼與細胞膜上的鈣離子和鈉離子通道受體結合後，會使得這些離子通道無法正常的關閉，造成離子的流失，從而影響神經、肌肉和心肌的功能，而導致死亡。
在研究毒蛙的分泌物過程中，研究者們發現到這些蛙不會自己合成有毒的生物鹼，而卻是從食物中攝取到含毒的物質，然後儲存到皮膚上的毒腺。研究成果顯示這些箭毒蛙可以從攝食到的許多昆蟲，包括：螞蟻、甲蟲、蚜蟲和馬陸，獲取高達800 種以上的生物鹼類毒物。但這項發現又引發了另一個有趣的問題，那就是：這些毒蛙是用什麼樣的機制，避免自己被累積的生物鹼所毒害呢？這問題多年來困擾了許多研究者，而要到最近研究者們經由使用電生理及分子生物學技術，去研究箭毒蛙細胞膜上離子通道基因的突變，才得以找到答案。
2017 年9 月22 日美國德州大學奧斯汀校區整合生物學系扎康（Harold Zakon） 教授（ 筆者博士論文的指導教授之一，也是第一個博士後的指導教授）的團隊在Science 期刊發表了論文，顯示了蛙毒之一的「表巴蒂啶（epibatidine）」之所以有毒性，主要是它會與尼古丁乙醯膽鹼受體結合，導致了正常的乙醯膽鹼無法與受體結合，從而阻斷了神經訊號的傳導。而且即使是微公克（microgram）的劑量，就會導致死亡。
對28 種分趾蟾科的毒蛙及12 種不含毒物的蛙，經由電生理及分子生物學的研究，確認了在毒蛙身上的尼古丁乙醯膽鹼受體上，有一個胺基酸序列的變異，導致蛙體內尼古丁乙醯膽鹼受體靈敏度的降低，因而不會與「表巴蒂啶」蛙毒結合，體內累積的毒素，不會對毒蛙自己造成毒害。但是乙醯膽鹼是毒蛙要活下去所必要的神經傳導物質，雖然受體上的突變，可避免與累積的蛙毒結合，但也會降低與乙醯膽鹼的結合。因而演化上的另一傑作，就是乙醯膽鹼受體上有另一個胺基酸序列的變異，使得它能與乙醯膽鹼正常的結合，進行神經訊號的傳導。換句話說，受體上兩個胺基酸的替換，一方面可使毒蛙不被自己儲存的毒素殺死；而另一方面，卻又能維持正常的乙醯膽鹼神經傳導的功能。
很湊巧的是，在上述的論文發表4 天後，紐約州立大學阿爾卑尼校區的黃秀雅、王經國夫婦（筆者臺灣大學動物系高我兩屆學長、姊。我曾於2001 前往王經國教授在哈佛大學醫學院的實驗室，進行鈉離子通道電生理的研究），在「美國國家研究院學報（PNAS）」上發表了一篇金色箭毒蛙（Phyllobates terribilis），如何避免被自己儲藏的蛙毒所害的機制的論文。金色箭毒蛙能透過食物將蟾毒素（BTX）儲藏在皮膚，以達自衛的作用。蟾毒素進入動物體內，會使得「電壓門控型鈉離子通道（voltage-gated Na+ channel）」持續保持開啟的狀態，而導致動物的死亡。他們發現在蛙體上，鈉離子通道上的蟾毒素受體上的天門冬醯胺酸（asparagine）被蘇胺酸（threonine）所取代後，蟾毒素就不會與鈉離子通道結合，因而不會對自己造成毒害。造成這胺基酸的取代主要是由AAC核苷酸，突變成ACC 所導致的。
前述的兩篇論文，分別分析了箭毒蛙如何演化出避免表巴蒂啶及蟾毒素這兩種生物鹼，在牠們體內造成毒害的機制。但除了這兩大類的生物鹼外，毒蛙對其它種類的生物鹼，是使用哪些機制來保護自己，會是很有挑戰性的研究題目。
延伸閱讀
1. Rebecca D. T. et al., Interacting amino acid replacements allow poison frogs to evolve epibatidine resistance, Science, Vol. 357: 1261-1266, 2017.
2. Sho-Ya Wang and Ging Kuo Wang, Single rat muscle Na+ channel mutation confers batrachotoxin autoresistance found in poison-dart frog Phyllobates terribilis, PNAS, Vol. 114: 10491-10496, 2017.