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2015-12-01物種基因剔除技術爆炸性的新突破─ CRISPR/Cas9技術淺談
552 期
Author 作者
林翰佐 銘傳大學 生物科技學系助理教授
前傳─故事得從「基因剔除鼠」開始講起⋯
物種基因剔除技術是生命科學研究上的一種終極手段，用來了解特定基因在生命發展過程當中扮演的角色。就如你對別人的好，往往都是你不在身邊時，別人才有清楚的感受一樣，透過抑制特定基因表現的手段，我們可以藉由觀察胚胎或動物生理上的變異情形，進而瞭解該基因的運作。想要在動物身上進行基因剔除，最著名的莫過於「基因剔除鼠」（knockout mice）的技術。這個運用基因同源性重組（homologous recombination）的原理，以及胚胎幹細胞（embryonic stem cells）培養 所組合而成的龐大生物工程，在發展的三十餘年間，滿足了科學家們對研究上的需求。據悉，到目前為止， 科學家們透過這個技術在老鼠的基因體（genome）當中，研究了逾半（約1萬多個）的基因，對人類生命科學的貢獻難以計數。也因此，在2007年的諾貝爾生醫獎，特別授與當初提出相關構想的卡佩奇（Mario Capecchi）等三位教授。
就科學與技術的角度來看，基因剔除鼠的研究設計十分完美，科學家們得以運用分子生物學研究工具，精確的掌握實驗的每一個階段，過程透明，沒有灰色地帶。若說有甚麼問題的話，我想應該是複雜的工序、過高的技術門檻以及龐大資金的需求，這使得基因剔除鼠淪為大型實驗室專屬的研究工具，成為研究奢侈品。直至目前為止，一件訂製基因剔除鼠的專案，價格仍高達15 萬美元，所以市場上仍有一大部分的研究需求無法由基因剔除鼠技術獲得。在2010年前後所發表的CRISPR/Cas9物種基因剔除技術，恰恰彌補了市場需求上的不足，所以短短五年的時間內即有爆炸性的發展，成為學術界的新趨勢。
兩項重要關鍵
在進一步談論主題前，我首先解釋一下物種基因剔除技術在發展上的兩項重要關鍵，分別為（1）具有找到目標基因的方式（gene targeting），（2）具有破壞或取代目標基因的方法。在基因剔除鼠的技術當中，科學家們用一段與目標基因「相似但不完全相同」的DNA補丁（patch）與目標基因互換， 藉此來改變目標基因的表現，而近年來的新興基因 剔除技術，主要是利用源自原核生物體內的一些 DNA內切酶（如後文的Cas蛋白）攻擊特定DNA 所產生的破壞來達到類似的效果。基因剔除鼠的同 源性重組原本就是一種具有專一性置換的方法，缺點是成功機率很低，約只有百萬分之一，所以科學家們巧妙的整合胚胎幹細胞的培養、基因轉殖以及細胞篩選的手段來提升成功機率。而新的方法中則 歷經鋅指核酸酶（ZFN）與類轉錄活化因子核酸酶 （TALEN）技術，終至CRISPR/Cas9技術始大放 異彩。基因剔除鼠與CRISPR/Cas9技術之間的差 異，在表一中做了整理，方便讀者參考。
表一:基因剔除技術大PK。
本篇─在細菌身上所發現的免疫機制
CRISPR/Cas9的全名為「常間回文重複序列叢集關聯蛋白」（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/ CRISPR associated protein 9），這個名稱主要是源自細菌以及古菌身上的免疫系統。目前我們所理解的運作方式如圖一，主要是對抗外來DNA（如噬菌體）的入侵，Cas蛋白會辨認外 來DNA上的特徵，然後將其水解消滅。不過，故事並非到此結束，為了增進抗病的效率，多數的免疫系統均會發展它們獨特的「記憶」，CRISPR 系統也不例外， 外來病源DNA並不會完全被水解殆盡，而是經過加工後，被鑲嵌在細菌自己的基因體中。這個稱為CRISPR array的特殊區段能夠轉錄，成為一張「嫌犯名單」，而系統中的Cas III蛋白則會利用這些RNA片段去辨認 可疑的DNA片段，並消除吻合序列的目標。
整個機轉中，Cas III蛋白的獨特能力受到科學家們的 青睞，很適合作為物種基因剔除技術的元件，其中Cas9 蛋白最為常用，CRISPR/Cas9的名稱便是由此而來。
圖一：細菌中CRISPR/Cas9的免疫防禦機制。(Crispr" by James atmos - Licensed under CC BY-SA 3.0 via Wikimedia Commons)
雙股 DNA 斷裂的修復機制
簡單的說，CRISPR/Cas9技術就是利用Cas9蛋白質 可切割特定的基因，來達到基因剔除。不過，單單切割 DNA，就可以抑制DNA表現嗎？對細胞來說，雙股 DNA斷裂是一種嚴重的傷害，細胞必定會執行修復， 想要完整修復，需要有適合的「參考範本」，像是雙股DNA的對向互補股，我們相信，在演化上，DNA以雙 股螺旋方式存在的道理源自於此。當DNA的雙股同時 斷裂，將會失去DNA訊息的連續性，這就成為一個棘手的問題，目前已知細胞可經由兩種途徑進行修復（圖二）。傳統的途徑稱為雙股同源互換（homologous recombination），主要是向另一條同源染色體「借」 一股DNA作為參考基礎（模板），然後完美修復受損 的DNA；不過本文關注的焦點，是另一套系統，稱為非同源互換端點黏合系統（non-homologous end joining, NHEJ）。相較於前者，這套系統的修復顯得有些草率，它藉由特殊蛋白質結合上雙股DNA斷裂的斷口，然後把這些DNA「黏起來」，中間並不包括去 辨認任何的DNA序列。即便NHEJ系統聽起來十分粗糙，事實上這是因應危機處理上的權宜之計，在細胞分 裂的狀況下，發生雙股斷裂會造成複製的染色體無法完 全分配。因為NHEJ系統草率的修復，所以很多時候 會在斷口附近遺失一到數個DNA分子，形成「缺失」 （deletion）突變。如果接點在某個基因當中，缺失突變可能會發生密碼子的「框架移動」（frameshift）， 意思是，這個基因無法合成對應的蛋白。
圖二：CRISPR/Cas9攻擊目標DNA所誘發之DNA修補機制的可能結果。
CRISPR/Cas9技術的原理，就是藉由Cas9蛋白攻擊目標基因，誘發細胞體內的雙股DNA修補之後產生有瑕疵的修復結果，因而達成基因剔除。
CRISPR/Cas9技術應用上的優缺點
其實就方法學上，利用新的基因尋標（gene targeting）以及藉由酵素攻擊特定基因誘發細胞NHEJ的不完美修復的設計，都並非為CRISPR/Cas9 技術首創，早期的鋅指核酸酶（ZFN）以及類轉錄活 化因子核酸酶（TALEN）的技術，均有相似的概念，尤其TALEN對目標基因的精確度，至今仍為其他新興方法所難望項背。CRISPR/Cas9技術之所以會受到相當的青睞，主要的理由是因為它採用核酸作為辨認目標基因的工具，這使得實驗操作成本得以大幅度的降低。針對特定基因來製備TALEN對應蛋白，合成費用約需1萬美元，但使用CRISPR/Cas9技術，成本可以下降到1000美元。而且CRISPR/Cas9技術在目標基因序列上的寬容度更高，不會受限於某些DNA序列的組合。由於並不需要使用胚胎幹細胞，這使得包括 CRISPR/Cas9技術在內的新興基因剔除技術可以廣泛的運用在各種生命體當中，並不像基因剔除鼠技術只能在小鼠當中進行。
聽起來，新興技術似乎十分的美好，不過這些方法也不是沒有「死穴」，它們最大的問題在於過程的不透明。 如前文所述，基因剔除鼠是以一段DNA補丁置換的方式處理成不活化的基因，特殊的DNA可以利用聚合酶鏈鎖反應法（PCR）驗證小鼠身上是否具有這樣的補丁，來確認實驗的成功性。而CRISPR/Cas9技術的驗證方式，除了在基因接合位置附近的缺失之外，並不會有其它外加的DNA序列標記可作為後續PCR檢驗的基礎，當在討論「脫靶」的可能性時，這項弱點使得證據力變得更加的薄弱。所謂「脫靶」，是指除了在目標基因之外，Cas9攻擊其他基因的可能性，這點在基因剔除鼠的研究中很容易被證明，但在這些新興的方法中，簡直有如海底撈針般困難。
結語─學術界的階級革命 CRISPR/Cas9技術從2010年被提出後，在短短的數年間即成為學術研究上的主流，除了方便操作、價格便宜之外，更具象的，它掀起了生命科學學術界的一場階級革命：原本只屬大型實驗室才能負擔的物種基因剔除研究，轉而成為普遍研究室都可以進行的實驗。資源、財力以及技術門檻在此一舉被攻破，我想這是 CRISPR/Cas9技術在最近能如此竄紅的主因。
基因剔除鼠以及CRISPR/Cas9技術有如光譜的兩端， 一端以精確透明的實驗流程見長，另一端則以價格優勢、低技術門檻取勝。你，會想用哪種方法呢？