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2019-05-01進化中的腦圖譜
593 期
Author 作者
李志昌／宜蘭大學生物機電工程學系兼任助理教授。
小鼠全腦數位3D細胞圖譜誕生
去（2018）年11月，在經歷5年的資料分析與整合後，藍腦細胞圖譜（Blue Brain Cell Atlas, https://bit. ly/2T9XWsW）於瑞士的神經科學研究機構洛桑聯邦理工學院（École polytechnique fédérale de Lausanne, EPFL）誕生。這個號稱第一個提供小鼠全腦數位3D細胞圖譜的平台，讓神經科學相關研究人員得以查閱與下載737個腦區的細胞資訊（如數量、密度與3D位置）、神經元調控性質（興奮性、抑制性或調節性）的類別及多種神經膠細胞的組成細節，且該圖譜還維持其動態性並可持續更新。
在此之前，類似可得的數據，只有來自不同研究機構分 散在特定小區域的研究，僅占不到全腦細胞的4％，此圖譜一次補足了之前缺乏的96％，其中很多腦區細胞量化分析過去較少被碰觸，因此彌足珍貴。然而，這樣的公開資料發表，只是一個過往雲煙的科學新聞，或是一個科學進展新的里程碑呢？
屬於腦的經緯度：腦區定位沿革
翻開神經科學的教科書，提到大腦分區的內容時，常會看到大腦表面起伏曲折的腦迴及不同切開的剖面，有如著色本，塗上不同的顏色，標註著一區一區的數字或名稱。這源自德國學者布洛德曼（Korbinian Brodmann）在1909年發表的專書，根據腦組織切片染色呈現的細胞分層結構變化訂出界線，將腦區分出的52個區域，百年來持續被沿用著。
帕西諾（George Paxinos）和華森（Charles Watson）合著的《大鼠腦圖譜》（The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates），曾是神經科學研究者不可或缺的工具書，無論手術、打藥或埋設記錄電極前，總要來回翻閱圖譜標示的核區名稱與座標，參照用尼氏染色（Nissl stain）或乙醯膽鹼酯酶染色（Acetylcholinesterase stain）的組織切片，在腦海中想像目標的樣貌。這本書自1982 年出版後，帕西諾等人多次修訂更新，除了紙本之外，也發行過電子版，讓讀者可以在電腦螢幕上翻閱、縮放與複製，著實便利了許多。除了大鼠之外，圖譜的物種也擴增到小鼠、恒河猴、狨猴、雞和人等版本，這一系列的腦圖譜著作，至今被引用超過6 萬次，其重要程度不言而喻。
組織關係連連看：互動式網路圖譜
已故的微軟創辦人之一艾倫（Paul Allen），在2003年贊助種子基金所成立的艾倫腦科學研究所（Allen Institute for Brain Science），短短幾年內便建立網路版的腦圖譜，提供即時圖文雙向互動的新體驗。
當滑鼠在腦圖上移到想要查閱的區域，結構的名稱隨即出現，亦可透過腦組織層級架構的樹狀名錄點選，或從搜尋框輸入結構名稱或縮寫，找到的結構會立即顯示在圖譜上。除此之外，可用滑鼠直覺式地縮放與拖曳，同步顯示的比例尺，切換標示圖譜或組織相片的顯示，甚至轉換不同方向的切面與不同年紀的多套圖譜，都可在一瞬之間完成。和傳統的紙本圖譜相比，互動式的網路圖譜是一大進化，這份標示超過700 個腦區的參考圖譜（https://bit.ly/2UG0OPP），也成了日後在圖譜上增建多層資訊的骨幹。
從平面到立體，從模糊到清晰⋯⋯
在參考圖譜上線的同時，大量規模的原位雜交（in situ hybridization）基因表現研究，以工業化式的方式在艾倫腦科學研究所進行，2006年上線的基因表現圖譜（Anatomic Gene Expression Atlas, AGEA）涵蓋了超過2000個基因於小鼠全腦表現的分布，2009年正式論文發表時，基因數據倍增到4376個，時至今日約有2萬個基因表現數據已完成，同時搭配3D立體展示的瀏覽器「Brain Explorer 2」，讓腦圖譜的展示方式邁入3D的里程碑。
此外，艾倫腦科學研究所另一條生產線正在海量生產「神經連結路徑」的資訊。透過腺相關病毒（adeno-associated viral, AAV）載體攜帶的螢光蛋白基因，微量注射到野生型（wild-type）小鼠不同的腦區，該腦區的投射路徑會被螢光蛋白表現的訊號標示，或透過cre驅動（credriver）品系的基因轉殖小鼠，以cre-loxp 重組技術產生螢光蛋白，標示特定族群的神經路徑。
完成路徑標定的全腦以膠體包埋固定，用全自動的切片裝置平整將其剖面，並以雙光子雷射掃描顯微系統將表層影像資訊數位化，每隔100微米（μm）逐層切削腦片同時取得影像，大約掃描140張切片，累積出750GB的影像數據，解析力達到350奈米（nm），如此建構出特定神經路徑在腦中的投射全貌，目前已累積2995個神經路徑追蹤的實驗數據。
圖譜越來越好用！技術進化的關鍵
傳統2D標示區域的參考腦圖，短短幾年內便在艾倫腦科學研究所經歷多次進化。第一次的進化是「電子化」與「互動查詢」，整合多套不同年齡、切片方向、物種的參考圖譜於同一查詢介面，可即時切換。接著，第二次進化是對「腦區功能的探索」，約2萬種已知的基因，先後在全腦進行大規模的基因表現調查，用全新的觀點賦予腦功能分區新的定義。第三次再進化是加入的「神經連結路徑」，讓不同腦區之間協同運作的網路，有一個明確描述的藍圖。
目前，這些不同類型的資料，都已經和標準的3D腦模型結合，可以套疊多次路徑追蹤實驗或是多個基因表現的資料同時呈現，預覽實驗中不容易實現的狀況，並能利用遮罩選擇繪圖範圍，從任意視角選擇最佳縮放比例，視覺上呈現有如在虛擬空間中遨遊的效果。對任一位置上的基因表現或是神經路徑想要更仔細了解，還可以在滑鼠點擊之後，呼叫出高解析的原始組織切片，甚至能與標示詳細的參考圖譜並排顯示。而單機版的3D 立體瀏覽器「Brain Explorer 2」也開始轉型為線上網頁的服務，目前beta 版（https://bit.ly/2ItsCAh）尚在建構中，相信進化完成後會帶來更先進功能的線上圖譜。
進化中的腦圖譜。（上）2D圖譜，提供位置名稱與座標供查閱；（中）2D互動式圖譜，滑鼠指到的位置，名稱即時出現，並可與組織切片原始圖像同步顯示；（下）3D互動式圖譜，可套疊多層基因表現或神經路徑的資訊，任意視角與縮放顯示，並可調閱任一點的原始數據圖像與參考圖譜。
從開放源資料，擁抱更強大的未來
有了橫切面與縱切面詳細標示腦區的2D互動式網路圖譜，有了3D的模型以及各種基因的表現數據，有了高解析腦區間投射的連結路徑，有了個腦區的細胞種類、數量、密度的資訊……，每隔一段時間，各種「有了」的喜訊再度成為新聞的焦點，進化中的腦圖譜便又立下一個新的里程碑。
而這次EPFL所發表的藍腦細胞圖譜，分析的原始腦切片資料與基因表現的數據，正是艾倫腦科學研究所的開放源資料。這個趨勢誠如該機構所倡議Big science（大規模、標準化）、Team science（跨領域、跨團隊）與 Open science（非營利、開放源）的發展方向，沿著這種進化的方向，持續將多元的資訊，加注到數位化的腦圖譜架構中，相信不久的將來，可以看到功能更強大，資訊更多元的數位腦圖譜。
延伸閱讀
1. Csaba Erö et al., A Cell Atlas for the Mouse Brain, Front. Neuroinform., 2018.
2.George Paxinos and Charles Watson, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Academic Press, 1982.
3.Seung Wook Oh et al., A mesoscale connectome of the mouse brain, Nature, Vol. 508: 207, 2014.