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今（2024）年的諾貝爾生理與醫學獎第三度頒發給研究線蟲的科學家，本次獲獎的得主分別為安布羅斯（Victor Ambros）和魯夫昆（Gary Ruvkun），以表彰他們發現線蟲時序調控基因「微型RNA」（microRNA, miRNA）。miRNA是一種非編碼基因，可用來做轉錄後的基因調控，且普遍存在於各類動植物中，並在分子生物學基因調控中建立了新典範。

分子生物學的誕生

1953年，華生（James Watson）和克里克（Franics Crick）解開DNA的雙股螺旋結構，從此揭開了分子生物學的序幕。他們發現DNA做為生物遺傳物質，可以透過解開雙股、各自作為模板合成互補股，並複製產生兩個完全相同的DNA，科學史家認為他們的發現是生命科學的第一次革命。而在1958年，克里克更進一步提出分子生物學的中心法則（central dogma），說明遺傳訊息會由DNA轉錄（transcription）成RNA，再由RNA轉譯（translation）成蛋白質，最後由蛋白質執行生命現象。之後的十年，許多分子生物學的奧祕陸陸續續被揭開，包括DNA聚合酶（DNA Polymerase）的發現及證實利用DNA聚合酶可以在試管內進行DNA複製，也證實細胞內mRNA的存在及mRNA每三個核苷酸會形成一個密碼子（codon），對應至一個胺基酸進行轉譯，並了解64個密碼子中的唯一的起始碼（AUG）對應到甲硫胺酸（methionine），而三個終止碼（UAG、UGG、UGA）則不對應到任何胺基酸而會使轉譯中止，發現這些重大事件的分子生物學家皆先後得到了諾貝爾獎。

1963年6月，證實mRNA存在於細胞內的布瑞納（Sydney Brenner）向他任職的卡文迪西實驗室（Cavendish Laboratory ） 所長皮魯茲（Max Perutz，1962年諾貝爾化學獎得主）寫了一封信，信中提到：「親愛的馬克斯，⋯在過去十年內，幾乎所有『古典』分子生物學的問題不是已被解開，就是在未來十年將被解開。我對分子生物學未來的研究，深感需要延續生物學不同領域來發展，比如重要的發育生物學和神經系統。因此我們要利用多細胞生物來作研究，牠需具有生活週期短的特性，像微生物一樣，容易養、體積小，可作大量的操作。牠應該只有很少的細胞數，可供深入細胞譜系的追踪，以及生物形態產生的研究，而且牠要有足夠量方便遺傳學的分析。」

模式動物－線蟲

於是自由生活在土壤且不具感染性的秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，簡稱線蟲），就被布瑞納挑選為模式生物。因為線蟲在實驗室中的飼養相當容易，只要餵食牠們大腸桿菌（Escherichia coli）、培養在25℃的溫度下即可。線蟲自體受精的卵會經過L1、L2、L3、L4等四個幼蟲期，幼蟲成為有生殖能力的成蟲只需三天半，且線蟲從受精卵到成蟲的狀態皆透明可見，便於利用顯微鏡進行細胞分裂和細胞譜系的觀察與追蹤。此外，成蟲身長約一毫米（mm），體細胞只有1000個左右，符合布瑞納理想中小型、簡單多細胞動物的條件。線蟲成體可分為雌雄同體和雄體，兩者都具有五對體染色體（染色體I∼V號），但前者有兩個性染色體（XX），後者僅具有一個性染色體（XO）。雄蟲在自然界較少，出現機率約為0.1％。一般雌雄同體的線蟲可經由同體受精繁殖後代，而在L4幼蟲末期，精原細胞經減數分裂會產生約300個單套染色體的精子。這些不具鞭毛、行阿米巴運動的精子，會先儲存在儲精囊內，成體時線蟲精原細胞的基因序列出現改變、開始產生卵子，卵子便會再和儲精囊內的精子結合形成受精卵。因此，一隻雌雄同體的線蟲一生約可產生200∼300隻子代。在理想狀態下，線蟲成蟲一星期內就可產下近一萬隻後代，且每隻後代具有相同基因，有如無性生殖的生物體，使牠們的基因可維持在純品系，提供簡單方便的遺傳分析。

因此，布瑞納試著以化學誘變劑「甲磺酸乙酯」（ethyl methanesulfonate, EMS）處理線蟲，通常經過EMS處理過的線蟲第一子代（F1）表現型不會有明顯變化，但是F1自體繁衍產生來的第二子代（F2），就有可能出現數量約為整體子代1/4的突變株。將這些F2出現的突變株單獨取出來培養，得到的第三子代（F3）如果全是突變株，就可以獲得純品系的突變株。這些突變株可以再進一步培養以擴增數量，並以冷凍保存，就能夠隨時解凍培養實驗用線蟲。布瑞納花了近十年，獲得300餘株與行為運動有關的線蟲突變株，他還透過雜交將每株的突變點定位於體染色體I∼V號及性染色體X上，建立了線蟲遺傳學的基石。

布瑞納的學生在之後的研究中陸續利用他建立的方法和基礎，開展發育和神經領域的研究，終於在本世紀初開花結果。2002年，布瑞納、霍維茲（Robert Horvitz）、薩爾斯頓（John Sulston）師徒三人共同獲得諾貝爾生理學與醫學獎，以表彰他們在器官發育與細胞凋亡（apoptosis）研究的貢獻。2006年，諾貝爾生理學與醫學獎再度頒給線蟲科學家——法厄（Andrew Fire）和梅洛（Craig Mello），獲獎原因是他們發現雙股RNA（double-straand RNA）會造成基因靜默（gene silencing）的現象。2008年獲得諾貝爾獎化學獎的查爾菲（Martin Chalfie）則是布瑞納的博士後研究員，他對於綠色螢光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的應用具有重大貢獻。今年的諾貝爾獎再度頒給線蟲科學家，以表彰他們發現時序調控基因lin-4和let-7的產物是長度只有22個核苷酸的miRNA，且這種非編碼基因可用於轉錄後的基因調控。

線蟲時序基因的發現

時序基因（heterochronic gene）對於動植物的發育非常重要，如果此基因調控失常，將造成動植物發育的遲緩（retardation）或早熟（precocious）等狀況。由於線蟲的生活週期只有三天半，是一種用於研究時序基因調控的理想模式，再加上線蟲的四個幼蟲期（L1∼L4）皆很好辨識，如果基因發生突變可能會造成牠的發育停滯在L1時期，稱作滯留型突變；若是線蟲從L3階段直接跳到成蟲，則稱做早熟型突變。

安布羅斯和魯夫昆實驗室在研究線蟲發育的時序調控時，獲得一株滯留型的突變株（lin-4）。他們此時已經知道lin-4可以負調控它下游的基因lin-14，使LIN-14蛋白無法被製造。安布羅斯實驗室想了解lin-4基因到底含有多少核苷酸，於是使用微注射的方式將含有lin-4的DNA片段打入突變株的卵細胞內，發現此線蟲產生的後代（F1）恢復為野生型。然而，這個能夠拯救滯留型線蟲的DNA片段只有693個鹼基對（base pairs），且不具有可以產生蛋白質的序列。為了慎重起見，他們另外又利用親緣關係相近的雙桅隱杆線蟲（Caenorhabditis briggsae）中，同源對應、具有693個鹼基對的DNA片段（同樣不含可產生蛋白質的序列）進行拯救lin-4突變株的實驗，最終獲得相同結果。他們也比較同一段基因序列在其他四種隱杆線蟲屬（Caenorhabditis）線蟲身上的情形。實驗結果顯示，lin-4基因在種間屬於保守序列（conserved sequence）；接著他們也證明lin-4基因可以產生兩種長短不一的RNA——lin-4S、lin-4L，分別含有22個核苷酸（22-nt）和61個核苷酸（61-nt）。22-ntRNA（即為miRNA）是由61-nt（即為pre-miRNA）剪切後形成，可以和另一個時序基因lin-14產生的mRNA3'非轉譯區（3'untranslated region, 3'-UTR）互補，抑制蛋白質的產生。

1993年，兩間實驗室分別將這項成果發表在《細胞》（Cell）期刊。但這項突破性的發現，當初並未受到生物學家的重視，他們認為僅有線蟲使用這種miRNA做轉錄後（post-transcription）調控，而其他生物身上並不會出現此現象。直到2000年，魯夫昆實驗室又發現了第二個時序調控基因「let-7」，他們以電腦比對各種生物的基因庫序列，發現let-7的核苷酸的序列也出現在其他生物體中，因此打開了這扇大門——miRNA的調控其實是一種普遍出現在生物界的現象。

miRNA的產生和作用

當發現miRNA對蛋白質的調控不僅只出現在線蟲身上，而是一種普遍的生物現象後，激發許多科學家開始朝向這個領域進行研究，像是探討miRNA如何產生、每種生物到底有多少種miRNA、哪些mRNA會受到miRNA調控？

經過20多年的研究，目前科學家在271個物種中找到3萬8589種miRNA，而人類則具有超過2000種miRNA。此外，科學家也逐漸了解miRNA的合成途徑，大多都是經過自身DNA序列中的啟動子（promoter），由RNA聚合酶（RNA polymerase II或III）轉錄出pri-miRNA，然後在細胞核內經RNA水解酶（內含Drosha/DGCR8）組成的複合體（microprosessor），將pri-miRNA剪裁變成為約70∼120 nt的pre-miRNA，再透過蛋白質XPO5（Exportin-5）將pre-miRNA輸送到細胞質，經過三種不同的RNA水解酶（Dicer/TRBP/Ago2）處理產生成熟的miRNA。最後，miRNA結合RNA誘導沉默複合物（RNA-induced silencing complex, RISC） 後再和標靶mRNA結合，造成該mRNA無法生成蛋白質或降解（圖一）。由於miRNA和mRNA序列並不需要完全互補，只要有幾個核心核苷酸能夠對上即可，因此一個miRNA便可以對應到一個以上的不同mRNA，而一個mRNA也可以受數種不同的miRNA調控。

接下來，科學家開始陸續找尋不同物種的miRNA對生物體的影響。除了對發育器官造成影響外，它也會影響到癌症。由於癌症的產生機制之一包含抑癌基因的失能，像是人類的抑癌基因P53受到miR-34調控；其他的抑癌基因則分別被miR-7、 miR-124 、miR-137、miR-146b等不同miRNA調控。研究發現miRNA可以經由外泌體（exosome）分泌到細胞外，甚至進入血液中，因此有些癌細胞就可以分泌miRNA到它們想要轉移的組織、建立新的微環境，進而達成轉移的目的。除了癌症外還一些傳染性疾病，例如第四型人類皰疹病毒（Epstein-Barr virus, EBV）會感染B淋巴球，它便會利用自己的miRNA（即v-miRNA）長期住在B淋巴球內形成慢性感染。此外，它甚至還能竊取B淋巴球miR-21、miR-23a、miR-24、miR-27等的功能，讓淋巴球成為淋巴癌細胞，因此臨床上可以研發抑制miRNA功能的藥物來對抗癌症。

修正中心法則的miRNA

一般來說，諾貝爾獎不會重複給予類似的研究的題目，所以有些研究者覺得這次的獲獎和2006年小分子干擾RNA（small interfering RNA, siRNA）的發現有重疊，因為兩者都會藉由Dicer複合蛋白抑制mRNA的功能。但筆者認為兩者有顯著的不同，siRNA的發現屬於應用，而miRNA的發現則屬於基礎學理，修訂了中心法則中認為RNA都是用來轉譯蛋白的概念。miRNA可以作為蛋白質產生的調控者，除了有些miRNA擁有自己的啟動子外，有些miRNA位於其他有蛋白質編碼基因的內含子（intron）內，更加解釋了傳統上被認為「無用」的非編碼DNA實際上具有重要的生物功能。最後，如果要預測未來還有可能獲得諾貝爾獎的線蟲研究，筆者認為發現有關調控生物壽命長短的基因（daf-2／daf-16）最有機會。

筆者誠摯感謝王文竹老師和邱韻如老師對本文的斧正和建議。